RecQ helikáza je označení pro vysoce konzervovanou rodinu helikáz, které jsou díky své nepostradatelné roli v mnoha procesech souvisejících s DNA považovány za tzv. „ochránce“ genomu, protože se podílí na udržování stability genetické informace a zároveň potlačují vznik nádorového bujení.[Nakayama H, Nakayama K, Nakayama R, Irino N, Nakayama Y, Hanawalt PC. Isolation and genetic characterization of a thymineless death-resistant mutant of Escherichia coli K12: identification of a new mutation (recQ1) that blocks the RecF recombination pathway. Mol Gen Genet 1984, 195: 474-480][Mohaghegh P, Hickson ID. DNA helicase deficiencies associated with cancer predisposition and premature ageing disorders. Hum Mol Genet 2001, 10: 741-746] [Chu WK, Hickson ID. RecQ helicases: multifunctional genome caretakers. Nat Rev Cancer 2009, 9: 644-654]
Zatímco u bakterií a kvasinek byla identifikována pouze jedna RecQ helikáza, v lidských buňkách bylo objeveno dokonce pět RecQ homologních proteinů – RECQ1[Puranam KL, Blackshear PJ. Cloning and characterization of RECQL, a potential human homologue of the Escherichia coli DNA helicase RecQ. J Biol Chem 1994, 269: 29838-29845][Seki M, Miyazawa H, Tada S, Yanagisawa J, Yamaoka T, Hoshino S, Ozawa K, et al. Molecular cloning of cDNA encoding human DNA helicase Q1 which has homology to Escherichia coli Rec Q helicase and localization of the gene at chromosome 12p12. Nucleic Acids Res 1994, 22: 4566-4573], BLM (RECQ2) [Ellis NA, Groden J, Ye TZ, Straughen J, Lennon DJ, Ciocci S, Proytcheva M, et al. The Bloom's syndrome gene product is homologous to RecQ helicases. Cell 1995, 83: 655-666], WRN (RECQ3)[Yu CE, Oshima J, Fu YH, Wijsman EM, Hisama F, Alisch R, Matthews S, et al. Positional cloning of the Werner's syndrome gene. Science 1996, 272: 258-262], RECQ4 (RTS) a RECQ5 [Kitao S, Ohsugi I, Ichikawa K, Goto M, Furuichi Y, Shimamoto A. Cloning of two new human helicase genes of the RecQ family: biological significance of multiple species in higher eukaryotes. Genomics 1998, 54: 443-452]. Nepostradatelná biologická role RecQ helikáz je navíc podtržena tím, že mutace v genech BLM, WRN a RECQ4 jsou spojeny s velmi zákeřnými dědičnými onemocněními: Bloomovým (BS), Wernerovým (WS) a Rothmund-Thomsonovým syndromem (RTS). Tato genetická onemocnění jsou spojena s vyšší náchylností k rakovině, předčasným stárnutím a chromozomovou nestabilitou.[Ellis NA, German J. Molecular genetics of Bloom's syndrome. Hum Mol Genet 1996, 5 Spec No: 1457-1463][Yu CE, Oshima J, Wijsman EM, Nakura J, Miki T, Piussan C, Matthews S, et al. Mutations in the consensus helicase domains of the Werner syndrome gene. Werner's Syndrome Collaborative Group. Am J Hum Genet 1997, 60: 330-341][Kitao S, Shimamoto A, Goto M, Miller RW, Smithson WA, Lindor NM, Furuichi Y. Mutations in RECQL4 cause a subset of cases of Rothmund-Thomson syndrome. Nat Genet 1999, 22: 82-84]
Struktura a biochemická aktivita Podle experimentálních a bioinformatických analýz lze uvnitř polypeptidového řetězce RecQ helikáz rozlišit několik konzervovaných domén, určujících zároveň aktivitu jednotlivých proteinů. Hlavní domény RecQ helikáz jsou tři: helikázová, RecQ karboxy-terminální (RQC) a RNázováD C-terminální (HRDC) doména [Bernstein DA, Keck JL. Domain mapping of Escherichia coli RecQ defines the roles of conserved N- and C-terminal regions in the RecQ family. Nucleic Acids Res 2003, 31: 2778-2785]. Helikázová doména s rozsahem 450 aminokyselin zahrnuje motiv pro vazbu ATP, který je hlavním energetickým zdrojem pro samotnou helikázovou aktivitu. BLM a WRN, které patří mezi nejvíce prostudované RecQ proteiny, umí rozvinout nejrůznější DNA struktury zahrnující 3‘-převis, bublinové struktury, Y-formy, D-smyčky, křížovou DNA strukturu zvanou Holliday junctions (HJ) nebo G-kvadruplexové struktury [Suzuki N, Shimamoto A, Imamura O, Kuromitsu J, Kitao S, Goto M, Furuichi Y. DNA helicase activity in Werner's syndrome gene product synthesized in a baculovirus system. Nucleic Acids Res 1997, 25: 2973-2978][Karow JK, Chakraverty RK, Hickson ID. The Bloom's syndrome gene product is a 3'-5' DNA helicase. J Biol Chem 1997, 272: 30611-30614][Neff NF, Ellis NA, Ye TZ, Noonan J, Huang K, Sanz M, Proytcheva M. The DNA helicase activity of BLM is necessary for the correction of the genomic instability of bloom syndrome cells. Mol Biol Cell 1999, 10: 665-676]. RQC doména je důležitá pro strukturní celistvost proteinu (viz strukturní alignment) a také pro vazbu dvouřetězcové DNA [Guo RB, Rigolet P, Zargarian L, Fermandjian S, Xi XG. Structural and functional characterizations reveal the importance of a zinc binding domain in Bloom's syndrome helicase. Nucleic Acids Res 2005, 33: 3109-3124][Bennett RJ, Keck JL. Structure and function of RecQ DNA helicases. Crit Rev Biochem Mol Biol 2004, 39: 79-97]. Tato doména bude mít také pravděpodobně roli při zprostředkování proteinových interakcí RecQ helikáz s jinými proteiny.[Lee JW, Harrigan J, Opresko PL, Bohr VA. Pathways and functions of the Werner syndrome protein. Mech Ageing Dev 2005, 126: 79-86] Poslední HRDC doména je nejméně konzervovaná, nicméně pomocí rentgenové krystalografie bylo zjištěno, že je důležitá pro vazbu jednořetězcové DNA. Domény RQC a HRDC, důležité pro vazbu k DNA, u některých členů RecQ helikázové rodiny chybějí, např. RECQ4 postrádá obě domény [Bernstein DA, Keck JL. Conferring substrate specificity to DNA helicases: role of the RecQ HRDC domain. Structure 2005, 13: 1173-1182][Wu L, Chan KL, Ralf C, Bernstein DA, Garcia PL, Bohr VA, Vindigni A, et al. The HRDC domain of BLM is required for the dissolution of double Holliday junctions. EMBO J 2005, 24: 2679-2687]
Kromě výše popsaných domén se mohou RecQ helikázy mezi sebou lišit dalšími doménami, které mohou sdílet homologii s jinými proteiny a tím se liší i jejich vlastnosti a funkce v buňce. Příkladem může být WRN helikáza s exodoménou na N-konci, která zajišťuje exonukleázovou aktivitu WRN proteinu. [Mushegian AR, Bassett DE, Boguski MS, Bork P, Koonin EV. Positionally cloned human disease genes: patterns of evolutionary conservation and functional motifs. Proc Natl Acad Sci U S A 1997, 94: 5831-5836] Lidské RECQ helikázy se vyznačují nejen klasickou helikázovou aktivitou, tedy schopností oddělovat od sebe dva řetězce DNA za přítomnosti ATP. Na druhou stranu vykazují také velmi silnou tzv. annealing aktivitu, tj. zprostředkovávat nasedání komplementárních jednořetězcových úseků DNA do výsledného duplexu. [Macris MA, Krejci L, Bussen W, Shimamoto A, Sung P. Biochemical characterization of the RECQ4 protein, mutated in Rothmund-Thomson syndrome. DNA Repair (Amst) 2006, 5: 172-180]
Funkce Buněčný cyklus zahrnuje několik kroků, z nichž každý musí být efektivně a časově dokončen než započne krok následující. Během S-fáze buněčného cyklu buňka musí precizně duplikovat své chromozomy, které pak následně musí velmi přesně rozdělit během M-fáze. Avšak během S-fáze se může vyskytnout několik překážek, které mohou nejen ovlivnit buněčný cyklus, ale také mohou vést v následující M-fázi k chromozomové nestabilitě, která bývá obvykle příčinou vzniku některých neurologických onemocnění nebo nádorového bujení. [Mankouri HW, Huttner D, Hickson ID. How unfinished business from S-phase affects mitosis and beyond. EMBO J 2013, 32: 2661-2671]
vpravo|náhled|Buněčný cyklus. V dělící se buňce se střídá mitotická fáze (M) s interfází, kde se buňka připravuje na samotné dělení. První je G1 fáze, po ní následuje S fáze, ve které jsou duplikovány chromozomy a poté G2 fáze. V mitóze už dochází k samotnému rozchodu dceřiných chromozomů, ke karyokinezi a cytokinezi.
Replikace DNA Během replikace DNA se mohou vyskytnout překážky, které replikační mašinerie není schopná vyřešit, a proto dochází k předčasnému zastavení replikační vidlice
[Lambert S, Carr AM. Impediments to replication fork movement: stabilisation, reactivation and genome instability. Chromosoma 2013, 122: 33-45] . Problémy replikační vidlice mohou být způsobeny těmito překážkami: Adukty DNA, tedy pozměněné nukleotidy (nukleosidy nebo báze). Příčinou vzniku aduktů jsou obvykle elektrofilní organické látky, které vstupují do organismu z vnějšího prostředí anebo vznikají jako reaktivní metabolické intermediáty, se schopností atakovat nukleofilní centra v nukleových kyselinách a tímto poškozovat genetickou informaci. Jednořetězcové nebo dvouřetězcové zlomy, které vznikají především po expozici ionizujícím zářením, UV zářením (viz ultrafialové záření), genotoxickými chemikáliemi, ale také produkty vnitřního oxidativního metabolismu buňky. Kovalentně vázaný protein na DNA, který replikační helikáza není schopná odstranit. Problémy může také způsobovat setkání procesů replikace a transkripce. Různé intramolekulární sekundární struktury ssDNA (např. G-quadruplex) ve vedoucím řetězci rovněž vedou k zastavení replikační vidlice. Topologický stres, kdy se potkají dvě proti sobě jdoucí replikační vidlice. Tento problém je často nevyhnutelný rys eukaryotické replikace, ve které je obousměrná replikace iniciována z více počátků replikace podél každého chromozomu. RecQ helikázy se na odstranění replikačních překážek podílí mnoha způsoby. Jedna z nejdůležitějších funkcí je restart zastavené replikační vidlice. Výskyt poškození na vedoucím řetězci (DNA adukt) vede k zastavení replikační vidlice, avšak BLM a WRN podporují tzv. regresi replikační vidlice, což znamená oddělení nově nasyntetizovaných DNA vláken a jejich spojení, čímž vzniká čtyřcestná Holliday struktura [Ralf C, Hickson ID, Wu L. The Bloom's syndrome helicase can promote the regression of a model replication fork. J Biol Chem 2006, 281: 22839-22846] [Machwe A, Xiao L, Groden J, Orren DK. The Werner and Bloom syndrome proteins catalyze regression of a model replication fork. Biochemistry 2006, 45: 13939-13946] . Vzniklá Hollidayova struktura pak může migrovat zpět za pomocí zejména RECQ1, BLM nebo WRN, a tím dochází k obnovení replikační vidlice. [LeRoy G, Carroll R, Kyin S, Seki M, Cole MD. Identification of RecQL1 as a Holliday junction processing enzyme in human cell lines. Nucleic Acids Res 2005, 33: 6251-6257] [Karow JK, Constantinou A, Li JL, West SC, Hickson ID. The Bloom's syndrome gene product promotes branch migration of holliday junctions. Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97: 6504-6508] [Constantinou A, Tarsounas M, Karow JK, Brosh RM, Bohr VA, Hickson ID, West SC. Werner's syndrome protein (WRN) migrates Holliday junctions and co-localizes with RPA upon replication arrest. EMBO Rep 2000, 1: 80-84] Alternativně může být Hollidayova struktura rozštěpena strukturně specifickými endonukleázami, což vede ke kolapsu replikační vidlice, která pak musí být opravena pomocí procesu homologní rekombinace (viz níže. [Boddy MN, Gaillard PH, McDonald WH, Shanahan P, Yates JR, Russell P. Mus81-Eme1 are essential components of a Holliday junction resolvase. Cell 2001, 107: 537-548] [Ip SC, Rass U, Blanco MG, Flynn HR, Skehel JM, West SC. Identification of Holliday junction resolvases from humans and yeast. Nature 2008, 456: 357-361] [Sarbajna S, West SC. Holliday junction processing enzymes as guardians of genome stability. Trends Biochem Sci 2014, 39: 409-419] RecQ helikázy (zejména BLM a WRN) jsou schopné také díky své enzymatické aktivitě rozvíjet různé DNA struktury (G-quadruplexy, různé smyčky a vlásenky), které vznikají jako replikační „překážky“ vedoucího řetězce. [Bachrati CZ, Borts RH, Hickson ID. Mobile D-loops are a preferred substrate for the Bloom's syndrome helicase. Nucleic Acids Res 2006, 34: 2269-2279] Navíc BLM také zastává důležitou úlohu při řešení topologického stresu, který vzniká při setkání dvou protichůdných replikačních vidlic. Přesná molekulární podstata je jen velmi málo objasněna, avšak důležitou roli při řešení tohoto problému hraje komplex zahrnující BLM-TOPOIIIα(DNA Topoizomeráza IIIα)-RMI1-RMI2, proteiny, které jsou schopny topologický stres uvolnit.