Electroporación

A electroporación ou electropermeabilización é unha técnica microbiolóxica na cal se aplica un campo eléctrico ás células para incrementar a permeabilidade da membrana plasmática, para permitir que compostos químicos, fármacos, ou ADN entren n célula (o que se chama tamén electrotransferencia). En microbioloxía, o proceso de electroporación adoita usarse para transformar bacterias, lévedos, ou protoplastos de plantas ao introducirlles novo ADN codificante. Se as bacterias e plásmidos están mesturados no mesmo medio, os plásmidos poden transferirse ás bacterias despois de facer a electroporación, aínda que dependendo do que vai ser transferido poden usarse péptidos penetrantes na célula ou o CellSqueeze. A electroporación funciona pasando miles de volts a través dunha distancia de só 1 ou 2 milímetros de células en suspensión nunha cubeta de electroporación. Despois, as células teñen que ser manipuladas con coidado ata que teñan a oportunidade de dividirse, producindo novas células que conteñen plásmidos reproducidos. Este proceso é aproximadamente dez veces máis efectivo que a transformación química.

A electroporación é tamén moi eficaz para a introdución de xenes alleos en células en cultivos de tecidos, especialmente as células de mamíferos. Por exemplo, é utilizado no proceso de producir ratos knockout, así como no tratamento de tumores, terapia xénica e a terapia baseada en células. O proceso de introducir ADN alleo en células eucariotas denomínase transfección. A electroporación é moi eficaz para transfectar células en suspensión usando cubetas de electroporación. É tamén útil para o seu uso en tecidos in vivo, para aplicacións in utero e para a transfección in ovo. As células adheridas poden tamén ser transfectadas usando a electroporación, proporcionando aos investigadores unha alternativa á tripsinización das células antes da transfección. Porén, un inconveniente da electroporación é que despois do proceso da expresión xénica uns 7 000 xenes poden verse afectados. Isto pode causar problemas en estudos nos que a expresión xénica ten que ser controlada para asegurarse de que os resultados son exactos e precisos.

A fusión celular é interesante non só como proceso artificial en bioloxía celular, senón tamén un método útil en biotecnoloxía e medicina. A fusión inducida artificialmente pode utilizarse para investigar e tratar diferentes doenzas, como a diabetes,McClenaghan, N. H. Physiological regulation of the pancreatic β-cell: functional insights for understanding and therapy of diabetes. Exp. Physiol. 92, 481–496 (2007).Yanai, G. et al. Electrofusion of mesenchymal stem cells and islet cells for diabetes therapy: A rat model. PLoS ONE 8, e64499 (2013).McCluskey, J. T. et al. Development and functional characterization of insulin-releasing human pancreatic beta cell lines produced by electrofusion. J. Biol. Chem. 286, 21982–21992 (2011). rexenerar axóns do sistema nervioso central,Sretavan, D. W., Chang, W., Hawkes, E., Keller, C. & Kliot, M. Microscale surgery on single axons. Neurosurgery 57, 635–646 (2005). e produce células coas propiedades desexadas, como en vacinas de células para a inmunoterapia do cancro.Guo, W., Guo, Y., Tang, S., Qu, H. & Zhao, H. Dendritic cell-Ewing's sarcoma cell hybrids enhance antitumor immunity. Clin. Orthop. 466, 2176–2183 (2008).Koido, S. et al. Regulation of tumor immunity by tumor/dendritic cell fusions. Clin. Dev. Immunol. 2010, 516768 (2010).Avigan, D., Rosenblatt, J. & Kufe, D. Dendritic/tumor fusion cells as cancer vaccines. Semin. Oncol. 39, 287–295 (2012). Porén, a primeira e máis coñecida aplicación da fusión celular é a produción de anticorpos monoclonais na tecnoloxía dos hibridomas, na que se forman liñas de células híbridas (hibridomas) pola fusión de linfocitos B produtores de anticorpos específicos cunha liña célular de mieloma (cancro de linfocito B).Vor dem Esche, U. et al. Passive vaccination with a human monoclonal antibody: generation of antibodies and studies for efficacy in Bacillus anthracis infections. Immunobiology 216, 847–853 (2011).Trontelj, K. et al. Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells. Bioelectrochemistry 74, 124–129 (2008).

Práctica de laboratorio

miniatura|230px|Cubetas para a electroporación in vitro. Son de plástico con eléctrodos de aluminio e unha tapa azul. Teñen unha cabida máxima de 400 μl. A electroporación realízase con electroporadores, aparellos construídos con ese propósito que crean un campo eléctrico nunha solución de células. A suspensión de células é pipeteada nun vaso ou cubeta de plástico, que ten nos seus lados dous eléctrodos de aluminio. Para a electroporación bacteriana, utilízase normalmente unha suspensión duns 50 microlitros. Antes da electroporación, esta suspensión de bacterias mestúrase cos plásmidos para ser transformado. A mestura é pipeteada na cubeta, establécense a voltaxe e a capacitancia, e a cubeta insírese no electroporador. O proceso require un contacto directo entre os eléctrodos e a suspensión. Inmediatamente despois da electroporación, engádese un mililitro de medio líquido á bacteria (na cubeta ou nun tubo Eppendorf), e incúbase o tubo á temperatura óptima da bacteria durante unha hora ou máis para permitir a recuperación das células e a expresión do plásmido, seguido do cultivo bacteriano en placa de ágar.

O éxito da electroporación depende en gran medida da pureza da solución de plásmidos, especialmente no seu contido de sal. As solucións con altas concentracións de sal podería causar unha descarga eléctrica (arco eléctrico), que a miúdo reduce a viabilidade das bacterias. Para unha investigación máis detallada do proceso, debe prestarse moita atención á saída de impedancia do aparello porador e á entrada de impedancia da suspensión de células (por exemplo o contido de sal).

Como a membrana plasmática non pode ser atravesada pola corrente eléctrica (agás nas canles iónicas), actúa como un capacitador eléctrico. Ao someter as membranas a un campo elécrico de alta voltaxe producese a súa rotura temporal, o que orixina poros que son dabondo grandes como para permitir que as macromoléculas (como o ADN) entren ou saian da célula.

Adicionalmente, a electroporación pode utilizarse para incrementar a permeabilidade das células durante as inxeccións e cirurxía in utero. Particularmente, a electroporación permite unha transfección máis eficaz do ADN, ARN, ARN de forquita pequeno e todos os ácidos nucleicos de células de ratos e ratas. O éxito da electroporación in vivo depende grandemente da voltaxe, repetición, pulsos e duración. Os sistemas nervisos centrais en desenvolvemento son máis efectivos para a electroporación in vivo debido á visibilidade dos ventrículos para as inxeccións de ácidos nucleicos, así como o incremento da permeabilidade das células en división. A electroporación de embrións in utero inxectados realízase a través da parede uterina, xeralmente con eléctrodos de tipo fórceps para limitar os danos ao embrión.

Aplicacións médicas

A primeira aplicación médkica da electroporación utilizouse para introducir fármacos anticancro pouco permeantes nos nódulos tumorais.Mir LM, Belehradek M, Domenge C, Orlowski S, Poddevin B, Belehradek J Jr, Schwaab G, Luboinski B, Paoletti C (1991). Electrochemotherapy, a new antitumor treatment: first clinical trial, CR Acad Sci III 313:613-618 Axiña espertou grande interese debido ao seu baixo custo, facilidade de realización e seguridade. Concretamente, os vectores virais poden ter serias limitacións en termos de inmunoxenicidade e patoxenicidade cando se usan para a transferencia de ADN.Marshall E (1999). Gene therapy death prompts review of adenovirus vector, Science 286:2244–2245 (1999)

A electrotransferencia de xenes in vivo foi descrita primeiramente en 1991 Titomirov A, Sukharev S, Kistanova E (1991). In vivo electroporation and stable transformation of skin cells of newborn mice by plasmid DNA, Biochim Biophys Acta. 1088(1):131–134 e hoxe hai máis estudos preclínicos da electrotransferencia de xenes. O método utilízase para entregar unha gran variedade de xenes terapéuticos para o tratamento potencial de varias enfermidades, tales como: trastornos do sistema inmunitario, tumores, trastornos metabólicos, enfermidades monoxenéticas, enfermidades cardiovasclares, analxesia….Heller LC, Coppola D (2002). Electrically mediated delivery of vector plasmid DNA elicits an antitumor effect, Gene Ther 9:1321-1325Chuang IC, Jhao CM, Yang CH, Chang HC, Wang CW, Lu CY, Chang YJ, Lin SH, Huang PL, Yang LC (2004). Intramuscular electroporation with the pro-opiomelanocortin gene in rat adjuvant arthritis, Arthritis Research & Therapy, 6:R7–R14. . Accessed 2015-11-14.Vilquin JT, Kennel PF, Paturneau-Jouas M, Chapdelaine P, Boissel N, Delaère P, Tremblay JP, Scherman D, Fiszman MY, Schwartz K (2001). Electrotransfer of naked DNA in the skeletal muscles of animal models of muscular dystrophies, Gene Ther 8:1097-1107

O primeiro grupo en probar a electroporación para aplicacións médicas foi o de Lluis M. Mir no Instituto Gustave-Roussy. Neste caso, trataron de usar a electroporación reversible xunto con macromoléculas impermeables. A primeira investigación estudou como se poderían usar pulsos de nanosagundos en células humanas e foi realizada polos investigadores da Escola médica de Virxinia Occidental e a Universidade Old Dominion e publicado en 2003.

En canto á electroporación irreversible, o primeiro tratamento con éxito de tumores cutáneos malignos implantados en ratos completouse en 2007 por un grupo de científicos que conseguiron a ablación completa dun tumor en 12 dun grupo de 13 ratos. Realizaron isto enviando 80 pulsos de 100 microsegundos a 0,3 Hz cunha magnitude de campo eléctrico de 2500 V/cm para tratar os tumores cutáneos.

En porcos viuse que unha maior voltaxe de electroporación destrúe irreversiblemente as células diana dentro dun estreito rango mentres que as células veciñas non son afectadas, polo que representa un novo tratamento prometedor contra o cancro, enfermidades de corazón e outros estados de enfermidades que requiren a extracción do tecido. A electroporación irreversible desde entón probou ser efectiva para tratar o cancro humano, que os ciruruxiáns do Hospital Johns Hopkins e outras institucións agora usan a tecnoloxía para tratar os cancros pancreáticos que previamente se pensaba que eran inextirpables.

Ademais, informouse dos ensaios clínicos en fase I da electrotranferencia de xenes en pacientes con melanoma metastático.Daud A, DeConti R, Andrews S, Urbas P, Riker A, Sondak VK, Munster PN, Sullivan DM, Ugen KE, Messina JL, Heller R (2008). Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma, J Clin Oncol 26(36):5896–5903 Realizouse a entrega mediada por electroporación dun xene de plásmido codificante para a interleucina-12 (pIL-12) e monitorizáronse a seguridade, a tolerabilidade e os efectos terapéuticos. O estudo concluíu, que a electrotransferencia de xenes con pIL-12 é segura e ben tolerada. Ademais, a resposta completa ou parcial observouse tamén en metástases distantes e non tratadas, o que suxire un efecto de tratamento sistémico. Baseándose nestes resultados xa está planeado pasar aos estudos clínicos en fase II. Actualmente están en marcha varios estudos clínicos de electrotransferencia de xenes,http://clinicaltrials.gov nos que se monitoriza a seguridade, tolerabilidade e efectividade da inmunización cunha vacina de ADN, que é administrada por pulsos eléctricos.

Aínda que o método non é sistémico senón estritamente local, é a estratexia non viral máis eficaz para a entrega de xenes.

N-TIRE