350px|miniatura|Diferentes tipos de mutacións por indeis. O panel C é simplemente unha deleción e non unha mutación por desprazamento do marco de lectura.
Unha mutación por desprazamento do marco de lectura (ou por cambio da pauta de lectura) é unha mutación causada por indeis (insercións ou delecións) de certo número de nucleótidos na secuencia de ADN que non é divisible por tres. Debido a que a expresión xénica se realiza por medio de tripletes ou codóns, unha inserción ou deleción deste tipo pode cambiar o marco de lectura (o agrupamento de codóns), tendo como resultado unha tradución de proteínas completemente diferente da orixinal. Canto máis ao principio da secuencia ocorra a deleción ou inserción, máis se altera a proteína. Unha mutación de desprazamento do marco de lectura non é o mesmo que un polimorfismo dun único nucleótido, no cal se substitúe un nucleótido, en lugar de inserirse ou eliminarse un. Unha mutación por desprazamento de marco de lectura causará en xeral que os codóns que están despois da mutación codifiquen diferentes aminoácidos. A mutación por desprazamento do marco de lectura tamén altera o primeiro codón de terminación ou stop ("UAA", "UGA" ou "UAG") que se encontra na secuencia, pero tamén podería orixinar un codón de terminación novo situado antes do normal. O polipéptido que se crea podería ser anormalmente curto ou anormalmente longo e moi probablemente non será funcional.
As mutacións por desprazamento do marco de lectura aparecen en graves doenzas xenéticas como a enfermidade de Tay-Sachs; incrementan a susceptibilidade a certos cancros e clases de hipercolesterolemia familiar. En 1997, unha mutación de desprazamento do marco delectura foi asociada á resistencia á infección polo retrovirus VIH. Propúxose que estas mutacións son unha fonte de novidade biolóxica, que explicaría, segundo algúns autores, a creación da nailonase; porén, esta interpretación é discutible. Un estudo feito por Negoro et al (2006) atopou que era improbable que unha mutación deste tipo fose a causa, senón que posiblemente unha susbtitución de dous aminoácidos no sitio activo dunha esterase ancestral tivo como resultado a aparición da nailonase.
Introdución
A información que contén o ADN determina a función dunha proteína nas células de todos os organismos. A transcrición e tradución fan que esta información se comunique para fabricar proteínas. Porén, un erro na lectura desta comunicación pode causar que o funcionamento da proteína non sexa correcto e finalmente cause unha doenza, incluso se a célula ten unha serie de medidas correctoras.
250px|miniatura|O modelo do dogma central da bioloxía molecular
O dogma central
En 1956 Francis Crick describiu o fluxo de información xenética desde o ADN a unha secuencia específica de aminoácidos para fabricar unha proteína denominándoo dogma central da bioloxía molecular. Para que unha célula funcione correctamente, necesítase que as proteínas se produzan adecuadamente para desempeñaren as súas actividades estruturais e catalíticas. Para asegurar que o xenoma transmite satisfactoriamente a información, a célula incorpora mecanismos de corrección de probas como exonucleases e sistemas de reparación de discordancias durante a replicación do ADN .
Transcrición e tradución
Despois da replicación do ADN, a lectura dunha sección seleccionada de información xenética lévase a cabo por medio da transcrición. Os nucleótidos que conteñen a información xenética están agora nunha febra molde mensaxeira chamada ARNm. O ARNm únese a unha subunidade dun ribosoma e interacciona cun ARNr. A información xenética transportada nos codóns do ARNm é agora lida (decodificada) polos anticodóns do ARNt. A medida que se le cada codón (triplete), os aminoácidos se enlazan formando a cadea polipeptídica ata que se chega ao codón de finalización (UAG, UGA ou UAA). Nese momento, o polipéptido (proteína) está sintetizada e é liberada. De cada 1000 aminoácidos incorporados á proteína, normalmente só un é incorrecto. Esta fidelidade de recoñecemento dos codóns, indica a importancia de manter o marco de lectura correcto, o cal é asegurado por un axeitado apareamento de bases no sitio A do ribosoma, a actividade de hidrólise do GTP do factor EF-Tu, unha forma de estabilidade cinética e un mecanismo de corrección de probas unha vez que se libera EF-Tu.
O desprazamento do marco de lectura pode tamén ocorrer durante a tradución de retrovirus na célula, producindo diferentes proteínas a partir de marcos de lectura abertos solapantes, como as proteínas retrovirais gag-pol-env. Isto é bastante común en virus e tamén ocorre en bacterias e lévedos (Farabaugh, 1996). A transcriptase inversa, a diferenza do que fai a ARN polimerase II, pénsase que é unha poderosa causa da aparición de mutacións por desprazamento do marco de lectura. En experimentos só do 3 ao 13% de todo este tipo de mutacións ocorre por culpa da ARN polimerase II. En procariotas a taxa de erro que induce mutacións de dedsprazamento do marco de lectura é só de entre 0,0001 e 0,00001.
Hai varios procesos biolóxicos que contribúen a evitar estas mutacións. As mutacións inversas prodúcense cando a secuencia mutada cambia outra vez á secuencia orixinal de tipo silvestre. Outra posibilidade para corrixir a mutación é o uso dunha mutación supresora. Isto compensa o efecto da mutación orixinal ao crear unha segunda mutación, que despraza a secuencia que fai que se lean os aminoácidos correctos. Tamén se pode usar un ARN guía para inserir ou eliminar uridina no ARNm despois da transcrición, isto permite que se lea o marco de lectura correcto.
Importancia do codón ou triplete
300px|miniatura|O código de tres letras (codóns)
Un codón é un conxunto de tres nucleótidos, un triplete que codifica un determinado aminoácido. O primeiro codón estabiliza o marco de lectura. A secuencia do esqueleto de aminoácidos dunha proteína defínese polos sucesivos tripletes contiguos. Os codóns son a clave da tradución da información xenética para a síntese de proteínas. O marco de lectura establécese cando empeza a tradución do ARNm e mantense segundo se vai lendo un triplete tras outro. A lectura do código xenético está sometida a tres regras. Primeiro, os codóns lense en dirección 5' a 3'. Segundo, os codóns non se solapan e a mensaxe non tren ocos. A última regra, que xa se mencionou antes, é que a mensaxe se traduce nun marco de lectura fixo. 250px|miniatura|Exemplo de diferentes tipos de mutación puntual
Mecanismo
As mutacións de desprazamento do marco de lectura poden ocorrer aleatoriamente ou ser causadas por un estímulo externo. A detección de mutacións de desprazamento do marco de lectura poden ocorrer por varios métodos diferentes. Os desprazamentos de marco son só un tipo de mutación que pode orixinar proteínas incompletas ou incorrectas, pero explican unha significativa porcentaxe de erros no ADN.
Xenético ou ambiental
As mutacións xenéticas a nivel de bases nucleotídicas poden ser inducidas por factores ambientais. Realizouse un estudo ambiental sobre a produción de mutacións por desprazamento de marco de electura inducidos pola luz UV polas ADN polimerases deficientes na actividade exonuclease 3′ → 5′. No estudo a secuencia normal foi cambiada para estudar os marcos de lectura. Os encimas pol I Kf de Escherichia coli e a ADN polimerase mutante de T7 desprovistos da actividade exonuclease 3′ → 5′ producen reversións inducidas pola luz UV a maior frecuencia que as súas equivalentes exonucleases funcionais. Os datos indican que a perda de actividade de corrección de probas incrementa a frecuencia de desprazamentos de marcos de lectura inducidos pola luz UV.
Detección
Fluorescencia
Os efectos de bases veciñas e da estrutura secundaria para detectar a frecuencia de mutacións por desprazamento do marco de lectura foron investigadas en profundidade usando fluorescencia. O ADN etiquetado fluorescentemente, por medio de análogos de bases, permite estudar os cambios locais da secuencia de ADN. Os estudos sobre os efectos da lonxitude da febra cebadora revelan que se observa unha mestura de equilibrio de catro conformacións de hibridación cando as bass do molde fan un bucle que forma unha protuberancia, é dicir, unha estrutura flanqueada a ambos os lados por ADN dúplex. En contraste, observouse unha estrutura de dobre bucle cunha conformación de ADN non usual no seu bordo de augas abaixo cando as bases extruídas estaban situadas na unión cebador-molde, o que mostra que os aliñamentos incorrectos poden ser modificados pola estrutura secundaria do ADN veciño.
Secuenciación miniatura|Unha mutación por deleción altera todos os codóns que están despois dela e pode facer que a síntese proteica se deteña prematuramente ao formarse un codón de terminación novo.
A secuenciación de Sanger e a pirosecuenciación son dous métodos que se utilizaron para detectar mutacións por desprazamento do marco de lectura; porén, é probable que os datos xerados non sexan da máxima calidade. Aínda así, identificáronse 1,96 millóns de indeis por secuenciación de Sanger que non se solapan con outras bases de datos. Cando se observa unha mutación por despramento do marco de lectura compárase cos datos da Human Genome Mutation Database (HGMD) para determinar se a mutación ten un efecto prexudicial. Isto faise examinando catro características. Primeiro, a proporción entre o ADN afectado e conservado, segundo, a localización da mutación en relación ao transcrito, terceiro, a proporción de aminoácidos conservados e afectados e finalmente a distancia do indel ao final do exón.
A secuenciación masivamente paralela é un novo método que se pode utilizar para detectar mutacións. Usando este método, poden secuenciarse ata 17 xigabases á vez, a diferenza dos rangos máis limitados que permite a secuenciación de Sanger de só aproximadamente 1 quilobase. Disponse de varias tecnoloxías para realizar este test e esta sendo considerado para usalo en aplicacións clínicas. Cando se fan tests para diferentes carcinomas, os métodos correntes só permiten examinar un xene á vez. A secuenciación masivamene paralela pode testar varios cancros causantes de mutacións á vez a diferenza de diversos tests específicos. Un experimento para determinar a exactitude deste método de secuenciación máis moderno para 21 xenes e non tivo resultados de falsos positivos para mutacións por desprazamento do marco de lectura.
Diagnose
Nos Estados Unidos a patente (5.958.684) de 1999 de Leeuwen, detalla os métodos e reactivos para a diagnose de doenzas causadas por ou asociadas cun xene que ten unha mutación somática que deu lugar a unha mutación por desprazamento da pauta de lectura. Os métodos requiren proporcionar un tecido ou mostra fluída e realizar unha análise xénica para mutacións por desprazamento do marco de lectura ou unha proteína xerada por este tipo de mutación. A secuencia de nucleótidos do xene sospeitoso é proporcionada por secuencias xénicas publicadas ou por clonación e secuencición do xene sospeitoso. A secuencia de aminoácidos codificada polo xene predícese despois.US Patent 5,958,684 (September 28, 1999) "Diagnosis of Neurodegenerative Disease" by Leeuwen et al
Frecuencia
As mutacións ocorren malia as regras que gobernan o código xenético e os diversos mecanismos presentes nunha célula para asegurar a transferencia correcta da información xenética durante o proceso da replicación do ADN e durante a tradución; as mutacións por desprazamento do marco de lectura non son o único tipo. Hai polo menos outros dous tipos de mutacións puntuais recoñecidas, como son as mutacións con cambio de sentido e as mutacións sen sentido. Unha mutación por desprazamento do marco de lectura pode cambiar drasticamente a capacidade de codificación (información xenetica) da mensaxe. Pequenas insercións ou delecións (as de menos de 20 pares de bases) constitúen o 24% das mutacións que se manifestan en doenzas xenéticas actualmente recoñecidas.