miniatura|Imaxe de grans de pole tomada con MEV que mostra a característica profundidade de campo e tridimensionalidade das micrografías de MEV. miniatura|Primeiro MEV de M. von Ardenne miniatura|Principio operativo do MEV. miniatura|MEV coa cámara de mostras aberta miniatura|MEV de tipo analóxico. Un microscopio electrónico de varrido ou de varredura (MEV ou, en inglés, SEM, de scanning electron microscope) é un tipo de microscopio electrónico que produce imaxes dunha mostra varrendo (escaneando) a súa superficie cun feixe de electróns enfocado. Os electróns interaccionan cos átomos da mostra, producindo varios sinais que conteñen información sobre a topografía da superficie e composición da mostra. O feixe de electróns escanea nun modo raster (trama de mapa de bits) e a posición do feixe está combinada coa intensidade do sinal detectado para producir unha imaxe. No modo de MEV máis común, os electróns secundarios emitidos por átomos excitados polo feixe de electróns detéctanse usando un detector de electróns secundarios (detector Everhart–Thornley). O número de electróns secundarios que se pode detectar e así a intensidade do sinal, depende, entre outras cousas, da topografía do espécime observado. Algúns MEVs poden acadar resolucións de menos dun nanómetro.
Os espécimes obsérvanse en alto baleiro no MEV convencional, ou en baixo baleiro ou condicións húmidas no MEV ambiental ou de presión variable, e nun amplo rango de temperaturas crioxénicas ou elevadas con instrumentos especializados.
Historia
Segundo a exposición da historia da microscopia electrónica de varrido presentada por McMullan, esta empezou así: Aínda que Max Knoll sacou unha foto cunha anchura de campo-obxecto de 50 mm mostrando contraste canalizado co uso dun escáner de feixe de electróns, foi Manfred von Ardenne quen en 1937 inventouGB 511204 , von Ardenne, Manfred, "Improvements in electron microscopes", publicado o 15-08-1939 un microscopio cunha alta resolución ao escanear un raster moi pequeno cun feixe de electróns finamente enfocado e desmagnificado. Ardenne aplicou o escáner de feixe de electróns para intentar superar a resolución do microscopio electrónico de transmisión (MET), e tamén para mitigar os problemas coa aberración cromática inherentes á obtención de imaxes reais no MET. Despois examinou os varios modos de detección, posibilidades e teoría do MEV, xunto coa construción do primeiro MEV de alta resolución. Traballos posteriores foron os presentados polo grupo de Zworykin,Zworykin VA, Hillier J, Snyder RL (1942) A scanning electron microscope. ASTM Bull 117, 15–23. seguido polos grupos de Cambridge na década de 1950 e principio da de 1960Oatley CW, Nixon WC, Pease RFW (1965) Scanning electron microscopy. Adv Electronics Electron Phys 21, 181–247.Wells OC (1957) The construction of a scanning electron microscope and its application to the study of fibres. PhD Dissertation, Cambridge University. liderados por Charles Oatley, todos os cales finalmente levaron á comercialización do primeiro instrumento comercial pola Cambridge Scientific Instrument Company co nome "Stereoscan" en 1965, que foi entregado a DuPont.
Principios e capacidades miniatura|Fonte de electróns de emisor Schottky. miniatura|Volume de interacción electrón–materia e tipos de sinais xerados.
Os sinais utilizados polo MEV para producir unha imaxe orixínanse polas interaccións do feixe de electróns con átomos a varias profundidades na mostra. Prodúcense varios tipos de sinais, como electróns secundarios, electróns reflectidos ou retrodispersados (BSE en inglés), raios X característicos e luz (catodoluminescencia), corrente absorbida (corrente de espécime) e electróns transmitidos. Os detectores de electróns secundarios son un equipamento estándar en todos os MEVs, pero poden non ter todos os outros detectores.
Os electróns secundarios teñen enerxías moi baixas da orde de 50 eV, que limitan o seu camiño libre medio na materia sólida. En consecuencia, os electróns secundarios só poden escapar desde a parte superior a poucos nanómetros da superficie da mostra. O sinal dos electróns secundarios adoita estar altamente localizado no punto de impacto do feixe de electróns primario, o que fai posible recoller as imaxes da superficie da mostra cunha resolución por debaixo dun nm. Os electróns retrodispersados son electróns do feixe que son reflectidos pola mostra por dispersión elástica. Como teñen moita maior enerxía que os electróns secundarios, emerxen de localizacións máis profundas do espécime e, en consecuencia, a resolución das imaxes de electróns retrodispersados é menor que a das imaxes de electróns secundarios. Porén, os electróns retrodispersados utilízanse a miúdo nos MEVs analíticos, xunto co espectro feito a partir dos raios X característicos, porque a intensidade do sinal dos electróns retrodispersados está moi relacionada co número atómico (Z) do espécime. As imaxes de electróns retrodispersados poden proporcionar información sobre a distribución, pero non a identidade, de diferentes elementos nunha mostra. En mostras compostas predominantemente de elementos lixeiros, como os espécimes biolóxicos, os electróns retrodispersados poden obter imaxes de inmunoetiquetados de ouro coloidal de 5 ou 10 nm de diámetro, que doutro modo serían difíciles ou imposibles de detectar en imaxes de electróns secundarios. Os raios X característicos emítense cando o feixe de electróns retira un electrón da capa interna dunha mostra, causando que un electrón de alta enerxía encha a capa e libere enerxía. A enerxía ou lonxitude de onda destes raios X característicos pode medirse por espectroscopia de raios X por dispersión de enerxía ou espectroscopia de raios X por dispersión de lonxitude de onda e usada para identificar e medir a abundancia de elementos na mostra e mapar a súa distribución.
Debido a que o feixe de electróns é moi estreito, as micrografías de MEV teñen unha gran profundidade de campo rendendo unha aparencia tridimensional útil para comprender a estrutura da superficie da mostra. Isto exemplifícase coa micrografía do pole que se mostra arriba. É posible un amplo rango de aumentos, desde 10× (equivalente aproximadamente á potencia dunha lupa de man) a máis de 500.000×, o que é unhas 250 veces o límite de aumento do mellor microscopio óptico.
Preparación da mostra miniatura|Unha araña pulverizada cuberta de ouro, preparada para vela nun MEV. miniatura|Micrografía de baixa voltaxe (300 V) da distribución de pingas adhesivas sobre unha nota post-it. Non se aplicou cobertura condutora: dita cobertura alteraría este fráxil espécime.
As mostras para MEV teñen que ser suficientemente pequenas para que se axusten á platina do espécime, e poden necesitar unha preparación especial para incrementar a súa condutividade eléctrica e estabilizalas, para que poidan soportar as condicións de alto baleiro e o feixe de alta enerxía dos electróns. As mostras xeralmente están montadas rixidamente sobre un soporte de espécime ou chatola (stub) usando un adhesivo condutor. O MEV úsase amplamente para analizar defectos de obleas ou wafers semicondutoras, e os fabricantes crearon instrumentos que poden examinar cada parte dunha oblea semicondutora de 300 mm. Moitos instrumentos teñen cámaras que poden inclinar un obxecto dese tamaño 45° e proporcionar unha rotación continua de 360°.
Os espécimes non condutores recollen a carga cando os escanea un feixe de electróns e, especialmente no modo de imaxe de electróns secundarios, isto causa fallos ao escanear e outros artefactos de imaxe. Para a obtención de imaxes convencionais nos MEVs, os espécimes deben ser condutores eléctricos, polo menos na superficie, e ter toma de terra para previr a acumulación de cargas electrostáticas. Os obxectos de metal necesitan pouca preparación especial para MEV excepto limpalos e montalos condutoramente nunha chatola (stub) de espécime. Os materiais non condutores son xeralmente cubertos cunha capa ultrafina de material electricamente condutor, depositado na mostra por cobertura por pulverización a baixo baleiro ou por evaporación a alto baleiro. Os materiais condutores en uso actualmente para cubrir os espécimes son o ouro, aliaxe ouro/paladio, platino, iridio, volframio, cromo, osmio, e grafito. A cobertura con metais pesados pode incrementar a razón sinal/ruído para mostras de baixo número atómico (Z).
Unha alternativa ao recubrimento dalgunhas mostras biolóxicas é incrementar a condutividade da masa do material por impregnación con osmio usando variantes do método de tinguidura OTO (O-tetróxido de osmio, T-tiocarbohidrazida, O-osmio).
Poden obterse imaxes de espécimes non condutores sen recubrilos usando MEV ambiental ou o modo de funcionamento de baixa voltaxe do MEV. Nos instrumentos de MEV ambiental o espécime sitúase nunha cámara de presión relativamente alta e a columna óptica de electróns é bombeada diferencialmente para manter adecuadamente baixo o baleiro no canón de electróns. A rexión de alta presión arredor da mostra no MEV ambiental neutraliza a carga e proporciona unha amplificación do sinal dos electróns secundarios. Os escaneos a baixa voltaxe realízanse nun instrumento cun canón de emisión de campo que pode producir unha alta brillantez de electróns primarios e pequenos tamaños de punto (spot size, o diámetro da zona onde o feixe incide sobre a mostraSpot size in scanning electron microscopy (SEM): why it matters!) incluso a potenciais de baixa aceleración. Para impedir a carga eléctrica de espécimes non condutores, as condicións de funcionamento deben axustarse de xeito que a corrente de feixe entrante sexa igual á suma das correntes de saída de electróns secundarios e retrodispersados, unha condición que adoita conseguirse a voltaxes de aceleración de 0,3–4 kV.
Pode realizarse unha incrustación en resina e posterior puído ata un acabado de espello tanto para espécimes biolóxicos coma para materiais cando se queren obter imaxes de electróns retrodispersados ou cando se fai unha microanálise de raios X cuantitativa.
As principais técnicas de preparación non son necesarias no MEV ambiental esquematizado máis abaixo, mais algúns espécimes biolóxicos poden beneficiarse da fixación.
Mostras biolóxicas
Para a observación de espécimes no MEV, estes normalmente deben estar totalmente secos, xa que a cámara de espécimes está a un alto baleiro. Os materiais duros e secos, como madeira, ósos, plumas, insectos secos ou cunchas e cascas de ovos poden ser examinados con pouco tratamento adicional, pero as células vivas e os tecidos en conxunto, os organismos de corpo mol necesitan unha fixación para preservar e estabilizar as súas estruturas.
A fixación realízase xeralmente por incubación nunha solución dun fixador químico tamponado, como o glutaraldehido, ás veces en combinación con formaldehido e outros fixadores, e seguido opcionalmente da posfixación con tetróxido de osmio. O tecido fixado é despois deshidratado. Como o secado ao aire causa colapso e engurramento, a deshidratación conséguese comunmente substituíndo a auga das células por solventes orgánicos como o etanol ou a acetona, e a substitución destes solventes á súa vez cun fluído transicional como o dióxido de carbono líquido por secado de punto crítico. O dióxido de carbono retírase finalmente mentres está en estado supercrítico para que non exista ningunha interface gas–líquido na mostra durante o secado.
O espécime seco móntase normalmente nunha chatola (stub) de espécime usando un adhesivo como a resina epoxy ou fita adhesiva de dobre cara que sexa condutora da electricidade, e recuberta por pulverización con ouro ou aliaxe de ouro/paladio antes do exame no microscopio. As mostras poden ser seccionadas (cun micrótomo) se a información sobre a ultraestrutura interna do organismo debe quedar exposta para obter imaxes.