Os modelos de enfermidades humanas isoxénicos son os conxuntos de células que son seleccionadas ou preparados por enxeñaría para serviren de modelos exactos da xenética dunha poboación de pacientes específica in vitro. Proporciónanse un par de liñas celulares que coinciden no seu fondo xenético, unha de "células normais" que serven de control para comparar, e a outra unha liña de células coas modificacións introducidas por enxeñaría, que serve de sistema isoxénico para investigar a bioloxía da enfermidade e novos axentes terapéuticos. Poden utilizarse como modelos de calquera doenza que teña unha base xenética. O cancro é unha desas doenzas para as cales se usan frecuentemente modelos de enfermidades humanas isoxénicos.
Modelos históricos Os modelos de enfermidades humanas isoxénicos foron equiparados a "pacientes nun tubo de ensaio", xa que incorporan as últimas investigación en doenzas xenéticas humanas sen as dificultades e limitacións que supoñen o uso de modelos non humanos.
Historicamente, as células obtidas de anmais, normalmente ratos, utilizáronse para serviren de modelos das vías relacionadas co cancro. Porén, hai obvias limitacións no uso de animais para estudar doenzas humanas. Malia a gran proporción de conservación xenética entre os humanos e os ratos, hai diferenzas significativas entre a bioloxía dos ratos e a dos humanos que son importantes na investigación do cacnro. Por exemplo, importantes diferenzas na regulación dos telómeros permiten que as células murinas sorteen a necesidade da regulación á alza da telomerase, que é un paso limitante da velocidade na formación dun cancro humano. Outro exemplo é que certas interaccións ligando-receptor son incompatibles entre os ratos e os humanos. Ademais, os experimentos demostraron importantes e significativas diferenzas na capacidade de transformar as células entre as dúas especies. Por estas razóns, é esencial desenvolver modelos do cancro que empreguen células humanas.
Vectores dirixidos a xenes
As liñas celulares isoxénicas créanse por un proceso chamado gene targeting homólogo. Os vectores dirixidos a xenes que utilizan a recombinación homóloga son ferramentas ou técnicas que se usan para realizar un knock-in ou un knock-out da mutación ou SNP (polimorfismo dun só nucleótido) desexados causantes da doenza para o seu estudo. Aínda que as células con mutacións propias de enfermidades poden recollerse directamente de pacientes de cancro, estas células adoitan conter moitas mutacións de fondo ademais da mutación específica de interese, e normalmente non se pode obter unha liña celular normal coincidente. Posteriormente, os vectores dirixidos a xenes (vectores de targeting) utilízanse para facer o knock-in ou knockout das mutacións xénicas, permitindo así ter un interuptor en ambas as direccións; dun xenotipo normal a outro canceroso, ou viceversa; en liñas celulares de cancro humanas caracterizadas, como HCT116 ou Nalm6.
Hai varias tecnoloxías de gene targeting usadas para preparar por enxeñaría a mutación desexada, as máis frecuentes das cales descríbense brevemente, indicando as súas vantaxes e limitacións, na táboa resumo de abaixo.
Técnica Knock-in de xenes Knock-out de xenes rAAV (vectores virus adenoasociados recombiantes) Créanse insercións ou modificacións dirixidas a xenes en xenes endóxenos; e son sometidas a: Mecanismos de regulación do xene correctos; e Reflicten con precisión os eventos que ocorren na doenza atopados en pacientes reais. O rAAV pode introducir mutacións puntuais sutís, ou SNPs así como pequenas insercións con alta eficiencia. Ademais, moitos estudos revisados por pares mostraron que o rAAV non introduce ningún evento xenómico fóra de diana que confunda.
Parece ser o método preferido adoptado pola academia, en biotecnoloxía e farmacia nun balance entre a precisión, o tempo e o custo.| Os knock-outs de xenes prodúcense nun locus endóxeno, e son definitivos, estables e relevantes para o paciente. Non orixinan efectos fóra de diana confusos noutros loci xenómicos. Requiren un proceso de dous pasos: Xeran un heterocigoto KO xeran un knock-out bialélico ao dirixir a alteración ao segundo alelo. Este proceso pode, por tanto, xerar 3 xenotipos (+/+; -/+ e -/-); permitindo a análise da función xénica haploinsuficiente.
A limitación actual é a necesidade de afectar secuencialmente cada alelo, facendo que obter as liñas celulares knock-out sexa un proceso en dous pasos.| Recombinación homóloga baseada en plásmidos A inserción prodúcese nun locus endóxeno e ten todos os beneficios anteriores, pero é moi ineficiente. Tamén require unha estratexia de selección dun fármaco sen promotor (promoterless) que supón a xeración dun construto feito a medida. Usando este método xerouse un gran banco histórico de liñas celulares que foi desprazado por outros métodos desde a metade da década de 1990. A deleción prodúcese nun locus endóxeno e ten todos os beneficios arriba mencionados, pero é inifeiciente. Tamén require unha estratexia de selección de fármaco sen promotor que supón a xeración dun construto feito a medida. Flip-in Esta é unha técnica eficiente que permite a inserción dirixida de transxenes "ectópicos" nun só locus xenómico predefinido (integración por medio dun sitio de recombinase FLP). Non é unha técnica para modificar un locus endóxeno. Os transxenes xeralmente estarán baixo o control dun promotor exóxeno, ou dun promotor-unidade parcialmente definido na localización xenómica incorrecta. A súa expresión non estará, pois, baixo a mesma regulación xenómica e epixenética que os loci endóxenos, o cal limita a utilidade destes sistemas para estudar a función xénica. Porén, son bos para orixinar unha expresión exóxena rápida e estable. Non aplicable. Nucleases dedo de cinc (ZFNs) As ZFNs conseguen altas taxas de knock-outs xenéticos nun xene endóxeno diana. Se os ZFNs son entregados xunto cun construto transxene homólogo no xene diana, poden conseguirse knock-in xenéticos ou insercións. Un posible inconveniente é que calquera rotura de dobre febra fóra de diana podía orixinar insercións aleatorias en xenes fóra de diana, delecións e maior inestabilidade xenómica; confundindo o xenotipo resultante. Porén, non se observou ningún incremento medible na taxa de integración aleatoria do plásmido en células humanas editadas eficientemente con ZFNs que se dirixen a un sitio de recoñecemento composto de 24 bp As ZFNs son endonucleases dirixidas a secuencia que permiten unha distorsión rápida e moi eficiente (de ata o 90 % nunha poboación celular en masa) de ambos os alelos dun xene diana, aínda que non se informou de alteracións definidas polo usuario ou perdas de función relevantes para o paciente a frecuencias similares. As delecións fóra de diana ou insercións noutra parte do xenoma son unha preocupación significativa. A vantaxe da velocidade con que se obtén un knock-out bialélico nun so paso é tamén parcialmente mitigada se aínda cómpre derivar unha liña celular clonal para estudar a función do xene nunha poboación celular homoxénea. Meganucleases As meganucleases son operativamene análogas ás ZFNs. Hai limiacións inherentes ao seu uso como que o deseño dun vector meganuclease pode tardar ata 9 meses e custar decenas de miles de dólares. Isto fai que as meganucleases sexan máis interesantes en aplicacións de alto valor como a terapia xénica, a agrobiotecnoloxía e a creación por enxeñaría de liñas bioprodutoras.
Recombinación homóloga en modelos de enfermidades de células cancerosas
A recombinación homóloga é un tipo de recombinación xenética na cal se intercambian as secuencias xenéticas entre dous segmentos similares do ADN. A recombinación homóloga xoga un importante papel na división celular eucariota, promovendo a diversidade xenética por medio do intercambio entre os segmentos correspondentes do ADN para crear novas combinacións potencialmente beneficiosas de xenes.
A recombinación homóloga realiza un segundo papel vital na reparación do ADN, permitindo a reparación das roturas de dobre febra no ADN que son algo común durante o ciclo de vida dunha célula. Este proceso é o que se desencadea artificialmente polas tecnoloxías antes mencionadas e impulsadas para orixinar 'knock-ins' ou 'knock-outs' en xenes específicos.
Un avance recente clave descubriuse usando vectores de recombinación homóloga de virus adeno-asociados (AAV), que incrementan as taxas baixas naturais de recombinación homóloga en células humanas diferenciadas cando se combinan con secuencias de vectores de gene targeting.
Comercialización Os factores que levaron á recente comercialización de modelos de doenzas cancerosas humanas isoxénicos para a industria farmacéutica e os laboratorios de investigación foron dous: Primeiro, patentar a tecnoloxía de vectores dirixidos a xenes mellorados proporcionaou a base para a comercialización dos modelos celulares que resultan da aplicación destas tecnoloxías. Segundo, a tendencia a ter taxas de éxito relativamente baixas na investigación e desenvolvemento de fármacos e o seu enorme custo creou unha necesidade real de novas ferramentas de investigación que mostren como responden positivamente subgrupos de pacientes ou son resistentes a terapias do cancro dirixidas baseándose nos seus perfís xenéticos individuais.
Notas
Véxase tamén Outros artigos AAV Recombinación FLP-FRT Enxeñaría xenómica Recombinación homóloga Plásmido Enxeñaria xenómica mediada por AAV recombinante Letalidade sintética Nuclease de dedo de cinc
Bibliografía
Endogenous Expression of Oncogenic PI3K Mutation Leads to Activated PI3K Signaling and an Invasive Phenotype Poster Presented at AACR/EORTC Molecular Targets and Cancer Therapeutics, Boston, USA, Nov. 2009
Endogenous Expression of Oncogenic PI3K Mutation Leads to accumulation of anti-apoptotic proteins in mitochondria Poster Presented at AACR 2010, Washington, D.C., EUA, abril de 2010 The use of 'X-MAN' isogenic cell lines to define PI3-kinase inhibitor activity profiles Poster Presented at AACR 2010, Washington, D.C., EUA, abril de 2010 The use of 'X-MAN' mutant PI3CA increases the expression of individual tubulin isoforms and promoted resistance to anti-mitotic chemotherapy drugs Poster Presented at AACR 2010, Washington, D.C., EUA, abril de 2010
Categoría:Xenética humana Categoría:Enxeñaría xenética Categoría:ADN