miniatura|180px|Foto dunha placa de inmunodifusión dobre de Ouchterlony unha vez que tivo lugar a inmunodifusión. Nesta, cuantifícase o valor de titulación dun antíxeno. O pozo central ten un anticorpo, e os pozos que o rodean teñen unha concentración decrecente do correspondente antíxeno. miniatura|180px|Padróns de Ouchterlony que mosran non-identidade entre os puntos superiores. thumb|180px|Padróns de Ouchterlony que mostan identidade completa entre os puntos superiores. miniatura|180px|Padróns de Ouchterlony que mostran identidade parcial entre os puntos superiores.
A inmunodifusión dobre de Ouchterlony (tamén chamada inmunodifusión dobre pasiva) é unha técnica inmunolóxica de inmunodifusión usada para a detección, identificación e cuantificación de anticorpos e antíxenos, como inmunoglobulinas e antíxenos nucleares extraíbles. A técnica recibe o seu nome polo médico sueco Örjan Ouchterlony, que desenvolveu o test en 1948 para avaliar a produción de toxinas diftéricas en bacterias illadas.
Procedemento
Córtase unha placa de xel para formar unha serie de buracos ("pozos") nun xel de ágar ou agarosa. Sitúase nun dos pozos un extracto da mostra de interese (por exemplo células humanas recollidas do tecido das tonsilas), noutro pozo colócase soros ou anticorpos purificados e déixase que se desenvolva a placa durante 48 horas. Durante este tempo os antíxenos no extracto da mostra e os anticorpos difunden ambos fóra dos seus respectivos pozos. Onde se encontran as dúas frontes de difusión, se calquera dos anticorpos recoñece algún dos antíxenos, unirase ao antíxeno e formará un inmunocomplexo. O inmunocomplexo precipita no xel para dar lugar a unha liña delgada fina (liña de precipitina), que é unha sinatura visual do recoñecemento do antíxeno. p. 176 p. 177
O método pode ser realizado en paralelo con múltiples pozos cheos con diferentes mesturas de antíxenos e múltiples pozos con distintos anticorpos ou mesturas de anticorpos, e a reactividade antíxeno-anticorpo pode verse ollando entre que pozos se produce o precipitado. Cando se usa máis dun pozo hai moitos posibles resultados sobre a reactividade do antíxeno e o anticorpo seleccionados. A zona de liñas de equivalencia pode dar lugar a unha identidade completa (é dicir, unha liña continua), unha identidade parcial (é dicir, unha liña continua cun esporón ao final), ou unha non-identidade (é dicir, dúas liñas que se cruzan completamente).
A sensibilidade do ensaio pode incrementarse usando unha tintura como o azul de Coomassie, o cal se fai por medio de repetidas tinguiduras e destinguiduras do ensaio ata que as liñas de precipitina teñan unha visibilidade máxima.
Teoría
A pecipiración ocorre coa maioría dos antíxenos porque o antíxeno é multivalente (é dicir, ten varios determinantes antixénicos por molécula aos cales poden unirse os anticorpos). Os anticorpos teñen polo menos dous sitios de unións aos antíxenos (e no caso da inmunoglobulina M fórmase un complexo multivalente con ata 10 sitios de unión a antíxenos), de maneira que se forman retículos similares a un xel de antíxenos e anticorpos. Experimentalmente, vaise aumentando a cantidade de antíxenos que se engade a unha cantidade constante de anticorpo en solución. Inicialmente, a concentacións baixas de antíxeno, todos os anticorpos están contidos no precipitado. Isto chámae a zona de exceso de anticorpo (é dicir, o fenómeno prozona). A medida que se adicionan máis antíxenos, a cantidade de proteína precipitada increméntase ata que as moléculas de antíxeno/anticorpo están nunha razón óptima. Isto coñécese como zona de equivalencia ou punto de equivalencia. Cando a cantidade dun antíxeno en solución excede a cantidade de anticorpo, a cantidade de precipitación diminuirá. Isto coñécese como a zona de exceso de antíxeno.
Notas
Véxase tamén Bibliografía
en Google Books
Ligazóns externas Simulator en Universidade de California, Irvine Fotografía de placa de inmunodifusión dobre de Ouchterlony con liñas de precipitina non tinguidas de identidade completa e de non identidade. Photographs of Ouchterlony immunodiffusion patterns showing stained precipitin lines of full identity, partial identity and non-identity.
Categoría:Técnicas de laboratorio Categoría:Probas inmunolóxicas