bélyegkép|RNSi-mediáció emlőssejttenyészetben
A kis interferáló RNS (siRNS), más néven rövid interferáló RNS vagy csendesítő RNS 20–24 (általában 21) bázispár hosszú, a miRNS-hez hasonló és az RNS-interferencia-útban (RNSi) résztvevő kétszálú, eleinte nemkódoló RNS-ek osztálya. Interferál a komplementer nukleotidszekvenciájú gének expressziójával az mRNS transzkripció utáni bontásával, megakadályozva a transzlációt. 50px A szöveg e Creative Commons Nevezd meg! 4.0 Nemzetközi Licenc alatt elérhető forrásból származik. 1998-ban fedezte fel Andrew Fire, a Carnegie Tudományos Intézet és Craig Mello, a Massachusettsi Egyetem dolgozója.
Szerkezet bélyegkép|siRNS sematikus ábrája
A természetes siRNS-ek szerkezete jól meghatározott, rövid (általában 20–24 bp) dsRNS foszforilált 5’- és hidroxilált 3’-végekkel két túlcsorduló nukleotiddal. A Dicer katalizálja a hosszú dsRNS-ekből és shRNS-ekből való siRNS-előállításts. A sejtekbe transzfekcióval vihetők be. Mivel elvben bármely gén expressziója csökkenthető komplementer siRNS-sel, azok fontos eszközök a génfunkció ellenőrzésére és a géncélzásra.
Történet 1998-ban Andrew Fire és Craig Mello felfedezték az RNSi-mechanizmust a Caenorhabditis elegans génexpresszióját vizsgálva. Az RNSi kutatásáért 2006-ban Nobel-díjat kaptak. A siRNS-eket és poszttranszkripciós géncsendesítésben (PTGS) játszott szerepüket növényekben fedezte fel David Baulcombe et al. a norwichi Sainsbury Laboratóriumban, és a Science-ben számoltak be róla 1999-ben. Thomas Tuschl et al. 2001-ben a Nature-ben számoltak be arról, hogy szintetikus siRNS-ek emlőssejtekben RNSi-t indukálhatnak. 2001-ben egy gén expresszióját kémiailag előállított siRNS emlőssejtekbe injektálásával csökkentették Tuschl et al. E felfedezések növelték az RNSi iránti érdeklődést az orvosi kutatás és a gyógyszerfejlesztés terén. A siRNS-terápiák jelentősen fejlődtek a szerves (szénalapú) és szervetlen (nem szénalapú) nanorészecskékkel, melyeket sikeresen használtak gyógyszerek agyba juttatásához. Azonban a humán siRNS-alkalmazás akadályai jelentősek, ezek egyike a nem specifikus hatás. Továbbá e terápiák elindíthatják a veleszületett immunitást. Az állatmodellek a válasz mértékét nem mutatják meg pontosan emberben, így a humán siRNS-terápiák tanulmányozása nehéz.
2020-tól siRNS-terápiákat fogadtak el és új módszerek jelentek meg e kihívások teljesítésében. Kaphatók elfogadott terápiák és néhány terápia elfogadásra vár.
Mechanizmus A természetes siRNS-ek általi transzlációrepressziós géncsendesítés mechanizmusa a következő: bélyegkép|300x300px|siRNS-hatásmechanizmus A hajtű-, komplementer RNS-ekből vagy RNS-dependens RNS-polimerázokból származó hosszú dsRNS-t a Dicer endoribonukleáz bontja. Ez a hosszú dsRNS-t siRNS-sé bontja, így kialakulhat az RNS-indukált csendesítőkomplex (RISC). Miután a siRNS a sejtbe lép, más fehérjékbe kerül, létrehozva a RISC-et A siRNS a RISC-ben egyszálú siRNS-ekké alakul. Az 5’-végi bázispárosodás miatt termodinamikailag kevésbé stabil szál a RISC része marad A RISC része megkeresi és megtalálja a komplementer mRNS-t Miután az egyszálú siRNS, a RISC része az mRNS-hez köt, annak bontását okozza. Az mRNS-t a siRNS vágja, ezért a sejt hibásként érzékeli, lebontja, így nem történik meg az mRNS transzlációja aminosavakká, így a fehérjeképzés se. Így az mRNS-t kódoló gén csendesül. A siRNS a miRNS-hez hasonlít, azonban utóbbiak rövidebb tőköri RNS-ekből származnak. A miRNS-ek elsősorban transzlációrepresszióval hatnak és szélesebb tartományban hatnak, míg a siRNS-ek specifikusabbak az mRNS transzláció előtti bontásával, teljes komplementaritással.
RNSi-indukció siRNS-ekkel vagy bioszintetikus prekurzoraikkal bélyegkép|Fehérjedoménenként színezett Dicer
Az exogén siRNS-transzfekciós knockdown gyakran nem megfelelő átmeneti hatásuk miatt, különösen gyorsan osztódó sejtekben. Ez megoldható expresszióvektorral. A siRNS-szekvenciához ekkor a két szál közé kis kört adnak. Az így kapott transzkriptum a Dicer által működő siRNS-sé a szokásos módon alakítható rövid hajtű-RNS (shRNS). Gyakran a transzkripciós kazetták RNS-polimeráz III-promotert (például U6 vagy H1) használnak a kis magi RNS-ek (snRNS) transzkripciójához (az U6 a splicingban vesz részt, a H1 a humán RNáz P RNázrésze). Feltehetően az így kapott siRNS-transzkriptumot a Dicer dolgozza fel.
A génknockdown-hatékonyság növelhető sejtnyomással.
A siRNS-ek aktivitása az RNSi-ben nagyban függ a RISC-kötő képességétől. A duplex siRNS RISC-kötését a szenz szál endonukleázok általi felnyitása és bontása követi. A fennmaradó antiszenz szál–RISC komplex a cél-mRNS-ekhez köthet a transzkripciós csendesítést elindítva.
RNS-aktiváció A dsRNS aktiválhat is génexpressziót, ez a kis-RNS-indukált génaktiváció, röviden RNSa. A promotercélzó dsRNS-ek a megfelelő gének jelentős transzkripciós aktivációját okozhatják. Ezeket humán sejtekben szintetikus dsRNS-ekkel – kis aktiváló RNS-ekkel (saRNS) mutatták ki. Nem ismert, mennyire állandósult az RNSa más élőlényekben. One report in the Aedes aegypti mosquito has shown there is some evidence for RNAa and can be achieved by short or long dsRNAs targeting promoter regions.
Poszttranszkripciós géncsendesítés A siRNS-indukált poszttranszkripciós géncsendesítést a RISC összeállása indítja el. Ez a génexpressziót a célgéneknek megfelelő mRNS-ek bontásával csendesíti. A folyamat kezdetén az antiszenz vezetőszál a RISC-be kerül, a szenz utasszál lebomlik. Egyes Dicerek felelhetnek a vezetőszál RISC-be helyezéséért. Ezután a siRNS ellenőriz és a RISC-et teljesen komplementer mRNS-szakaszhoz viszi. Az mRNS-bontást feltehetően az Argonaute fehérjék Piwi-doménje katalizálja. Az mRNS ekkor pontosan válik le a célnukleotidok közti foszfodiészter-kötés lebontásával, melyek a 10. és 11. siRNS-nukleotidok közt vannak az 5’-végtől számolva. Ez mRNS-töredékeket hoz létre, melyeket az exonukleázok tovább bontanak. Az 5’-töredéket a 3’-végtől bontja le egy exoszóma, a 3’-töredéket az 5’-végtől az 5’-3’-exonukleáz 1 (XRN1) bontja le. Az mRNS disszociációja a RISC-től további mRNS-ek csendesítését teszi lehetővé. E disszociációt valószínűleg az ATP-hidrolízis által segített külső faktorok segítik.
Néha a cél-mRNS nem bomlik le. Egyes esetekben az endonukleolitikus foszfodiészterváz-bontást a bontás helye körül a siRNS és a cél-mRNS közti eltérések gátolhatják. Máskor az Argonaute-fehérjék tökéletes mRNS–siRNS párosodás esetén se rendelkeznek endonukleázaktivitással tökéletes mRNS–siRNS-párosodás esetén. Ekkor a génexpressziót miRNS-indukált mechanizmus gátolja. bélyegkép|A Ping-Pong-módszer egyszerűsített változata, ahol az Aubergine (Aub) és az Argonaute-3 (Ago3) bontja a piRNS két végét.
A Piwi-kölcsönható RNS-ek (piRNS) transzpozonokat csendesítenek, ők nem siRNS-ek. Ezek 21–35 nt hosszú ncRNS-ek 2019-ben felfedezett osztálya. A génexpresszió-szabályzásban, a transzpozoncsendesítésben és a vírusfertőzés-gátlásban fontos. Korábban az ncRNS-ek „sötét anyagának” tekintették, és több sejtfunkcióban fontosak számos élőlényben.
Transzkripciós géncsendesítés Számos modellszervezet, például a növények (Arabidopsis thaliana), az élesztő (Saccharomyces cerevisiae), a legyek (Drosophila melanogaster) és a férgek (Chaenorhabditis elegans) használatosak kisnemkódoló-RNS-irányított transzkripciós géncsendesítéshez. A humán sejtekben az RNS-irányított transzkripciós géncsendesítést 2016-ban figyelték meg, mikor exogén siRNS-ek GFP-riportergénes transzgenikus elongációs faktor 1α-promotert inhibeáltak. Ennek fő RNSi-vel történő mechanizmusai a DNS-metiláció, a hisztonok poszttranszlációs módosulásai és a kromatin-újramodellezés a célgén körül egy DNS-régióban.
Allélspecifikus géncsendesítés A siRNS-ek lehetséges használata a cél- és nemcélszekvenciák egynukleotidos eltérés alapján való megkülönböztetése. Ez terápiás szempontból fontos a domináns funkciószerzéses rendellenességek csendesítésére, ahol a betegségokozó mutáns allél 1 nukleotidban tér el a vad típusútól. Ezen egynukleotidos eltérést megkülönböztető siRNS-ek allélspecifikus siRNS-ek.
Az ASP-RNSi új RNSi-kategória, melynek célja a domináns mutáns allél szupressziója a megfelelő normál allél expressziójának megtartásával egynukleotidos különbségeik alapján való specificitással. Az ASP-siRNS-ek új és feltehetően jobb alternatívák lehetnek autoszomális domináns genetikai rendellenességek kezelésére, ha a vad típusú allél expressziója a túlélés szempontjából fontos, például a Huntington-kór (HD), a DYT1-disztónia (Gonzalez-Alegre et al. 2003, 2005), az Alzheimer-kór (Sierant et al. 2011), a Parkinson-kór (PD) (Takahashi et al. 2015), az amiloid-laterálszklerózis (Schwarz et al. 2006) és a Machado–Joseph-kór esetén (Alves et al. 2008). Terápiás jelentőségüket bizonyos bőrbetegségek, például az epidermolysis bullosa simplex (Atkinson et al. 2011), az epidermolitikus palmoplantáris keratoderma (Lyu et al. 2016) és az I-es típusú mátrix-cornealisdisztrófia (LCDI) kezelésére (Courtney et al. 2014).
Nemspecifikushatás-elkerülés Az RNSi sok más útvonallal kölcsönhat, 2010-ig ezért alkalmanként nem specifikus hatásokat okozott a kísérleti siRNS-bevitel. Ha egy emlőssejt kétszálú RNS-t, például siRNS-t kap, vírusmelléktermékként értelmezheti, immunválaszt okozva. Továbbá mivel a hasonló szerkezetű mikro-RNS-ek nagyrészt nem teljesen komplementer bázispárok kölcsönhatásával hatnak a cél-mRNS-re, a siRNS-beadás nem kívánt célhibát okozhat. A siRNS kémiai módosítása is megváltoztathatja a termodinamikai tulajdonságokat és így az egynukleotidos specificitást.
Veleszületett immunitás Túl sok siRNS bevitele a veleszületett immunválasz miatt okozhat nem specifikus eseményeket. A legtöbb bizonyíték szerint ezt a PKR dsRNS-szenzor okozza, de a retinsav-indukálható gén I (RIG-I) is érintett lehet. A TLR7 általi citokinindukciót is észleltek. A kémiai siRNS-módosítást immunválasz-csökkentéshez használják a génfunkcióban és terápiásan. A nem specifikus hatások egy lehetséges csökkentési módja a siRNS miRNS-sé alakítása. A miRNS-ek a természetben előfordulhatnak, és ezen endogén út révén hasonló génknockdown érhető el alacsony siRNS-koncentráció és alacsonyabb nem specifikus hatások mellett.
Eltérés a céltól A céltól való eltérés is kihívás a siRNS-ek génknockdownra való használatában. Ekkor nem teljesen komplementer géneket csökkent a siRNS (vagyis miRNS-ként működik) adatinterpretációs és lehetséges toxicitást okozva. Ez azonban részben kezelhető megfelelő kontrollkísérletekkel, és siRNS-tervező algoritmusokat fejlesztenek. A genomszintű expresszióelemzés például mikroarray-kkel ennek ellenőrzésére és az algoritmusok pontosítására használható. Dr. Hvorova és társai 2006-os tanulmánya 6 vagy 7 bázispáros szakaszegyezéstt mutatott ki a 3’UTR-ekben nem megfelelően megtalált gének esetén. A siRNA-célok előrejelzésének eszköze ASPsiRNA-erőforrásként érhető el., az erőforrás itt található: ASPsiRNA
Adaptív immunválasz A tiszta RNS-ek rossz immuogének lehetnek, de az RNS-fehérje komplexekkel szemben könnyen készülhet antitest. Sok autoimmun betegségben ilyen antitestek vannak jelen. Nem ismert fehérjéhez kötött siRNS elleni antitest. Egyes siRNS-beviteli módszerek polietilén-glikolt (PEG) adnak az oligonukleotidhoz, csökkentve az exkréciót és növelve a felezési időt. Azonban egy nagy III. fázisbeli kísérletet a IX. faktort célzó PEG–RNS-aptamer kombinációval a Regado Biosciencesnek le kellett állítania a PEG-lal szembeni súlyos anafilaxiás reakció miatt, mely egyes esetekben halált okozott, és jelentős kérdéseket vet fel a siRNS-bevitelhez PEG-oligonukleotidok esetén.
RNSi-telítődés