A kromatográfia, amely a görög χρώμα: khróma, szín és γραφειν: graphein írni szavak összetétele, egy keverékek elválasztására használatos laboratóriumi módszercsalád neve.
A technika lényege egy az ún. mozgó (mobil) fázisban más néven eluensben oldott keveréknek egy álló (statikus) fázison való áthajtása, melynek során a vizsgálandó anyag elválik az elegyben található további molekuláktól.
A módszert két alapvető célra használjuk: preparatív vagy analitikai.
A preparatív kromatográfiában az elválasztott vegyületek további feldolgozása a végső cél, azaz egy tisztítási műveletről beszélhetünk. Az analitikai kromatográfia általában kisebb anyagmennyiségekkel dolgozik és célja az analit (kimutatandó vagy mérendő komponens) relatív arányának meghatározása a keverékben. A két cél nem zárja ki egymást.
A kromatográfia története A kromatográfia története a XIX. század közepétől a XXI. századig ível. A kromatográfia nevét a XX. század első évtizedében kapta, használata is ekkor kezdődött elsősorban növényi pigmentek, például klorofill elválasztására. Az 1930-as és 1940-es években kifejlesztett új kromatográfiás módszerek elválasztási folyamatok és kémiai analitikai feladatok széles körére tették alkalmassá a technikát, különösen a biokémia területén.
Több hasonló eljárást fejlesztettek ki a XIX. század során (sőt még korábban is), de az első igazi kromatográfia Mihail Szemjonovics Cvet orosz botanikus nevéhez köthető, aki klorofillon végzett kísérlete közben egy függőlegesen elhelyezett kalcium-karbonáttal töltött üvegcsövet használt növényi pigmentek elválasztására a XX. század első évtizedében. A módszert is ő nevezte el.
A kromatográfia modern formája Archer John Porter Martin és Richard Laurence Millington Synge az 1940–1950-es években végzett munkásságát követően alakult ki. Ők fektették le a megoszlási kromatográfia alapelveit és alapvető technikáit és munkájuk nyomán a megindult a kromatográfiás módszerek számos fajtájának (papír kromatográfia, gáz kromatográfia, valamint a manapság nagy teljesítményű folyadék kromatográfiaként ismert eljárás) gyors fejlődése. A megoszlási kromatográfia terén végzett munkásságukért Archer John Porter Martin és Richard Laurence Millington Synge 1952-ben Nobel-díjat kaptak.
Azóta a technológia gyorsan fejlődött. A kutatók megállapították, hogy a Cvet kromatográfiáját megalapozó elvek számos módon felhasználhatók, így alakulhatott ki a kromatográfia alábbiakban bemutatott számos válfaja. Ugyanakkor a kromatográfia technikai teljesítőképessége is folyamatosan javult, egyre inkább lehetővé téve nagyon hasonló molekulák elválasztását is.
Szakkifejezések IUPAC Nomenclature for Chromatography IUPAC Recommendations 1993, Pure & Appl. Chem., Vol. 65, No. 4, pp.819-872, 1993. Analitnak nevezzük a kromatográfia során elválasztandó anyagot. Az analitikai kromatográfia az analit(ok) mintában való jelenlétének bizonyítását (minőségi meghatározás) valamint lehetőleg koncentrációjának meghatározását (mennyiségi elemzés) jelenti. Kötött vagy immobilizált fázisnak a hordozó szemcsékhez vagy az oszlop belső falához kovalens kötéssel kötött álló fázist nevezzük. Kromatogram a kromatográf láthatóvá tett kimeneti jele. Optimális elválasztás esetén a kromatogram különböző csúcsai vagy mintázatai az elválasztandó keverék különböző komponenseinek felelnek meg.
300px|Kromatogram a csúcsok éles elválasztása nélkül
300px|Kromatogram két élesen elválasztott csúccsal
Az x koordináta a retenciós idő, az y koordináta pedig a rendszerből kilépő analit(ok) keltette válasz jel nagyságát. Az érzékelő berendezés lehet például spektrofotométer, tömeg spektrométer vagy számos más típusú detektor. Optimális rendszer esetén a jel arányos az elválasztott analit koncentrációjával.
Kromatográf a készülék mellyel lehetséges a megfelelő szintű elválasztás kivitelezése, például gázkromatográf vagy folyadék kromatográf. A kromatográfia fizikai elválasztási módszer, ahol az elválasztandó komponensek két fázis között oszlanak meg, ezek közül az egyik helyhez kötött (álló fázis), míg a másik adott irányba mozog (mozgó fázis). A mozgó fázis vagy eluens egy adott irányban áramlik. Lehet folyadék (LC vagy CEC), gáz (GC) vagy szuperkritikus folyadék (szuperkritikus folyadék kromatográfia SFC). Alternatív definíció szerint a mozgó fázis az elválasztandó / vizsgálandó mintát és mintát a kolonnán átvivő oldószert tartalmazza. A mozgó fázis keresztülhalad a kromatográfiás oszlopon (az álló fázison), ahol a minta kölcsönhatásba lép az állófázissal és megtörténik az elválasztás. Effluensnek nevezzük az oszlopról távozó mozgó fázist. A preparatív kromatográfia célja egy adott anyag további felhasználásra alkalmas mennyiségének tisztítása, nem pedig minőségi vagy mennyiségi meghatározása. A retenciós idő az adott analitnak adott körülmények között a rendszeren (a kolonna bemenettől a detektorig) való áthaladásához szükséges időtartam. A minta a kromatográfiával vizsgált anyag. Állhat egyetlen összetevőből vagy több komponens elegye is lehet. Ahogy a mérés során kezeljük a mintát, a vizsgált analito(ka)t tartalmazó fázist vagy fázisokat nevezzük mintának, míg a mérés során minden a vizsgált mintától elválasztott számunkra érdektelen részt hulladékként tekintünk. Oldott anyag megoszlási kromatográfiában a minta komponenseit jelenti Oldószer bármely anyag, amely képes más anyagokat oldatba vinni, különösen folyadékkromatográfiában a folyékony mozgó fázis. Álló fázis a kromatográfiás eljárás során helyben rögzített anyag, mint például vékonyréteg kromatográfiában a szilika réteg.
A kromatográfia fajtái a kromatográfiás ágy alakja szerint Oszlopkromatográfia Oszlopkromatográfiás elválasztási technika esetén az állófázis egy csőben található. A szilárd állófázis szemcséi vagy a hordozóra felvitt folyékony állófázis a cső teljes térfogatát megtöltheti (töltött oszlop) vagy a cső fala mentén koncentrálódhat nyitott, akadálymentes utat hagyva a mozgó fázisnak a cső középső részén (nyitott cső oszlop). A közegen való áthaladás sebesség különbségét a minta különböző retenciós ideiből számoljuk.
1978-ban W.C. Still új módosítását vezette be, melyet flash oszlop kromatográfiának nevezett.Still, W. C.; Kahn, M.; Mitra, A. J. Org. Chem. 1978, 43(14), 2923-2925. () Az eljárás nagyon hasonlít a hagyományos oszlop kromatográfiához, az eltérés csak annyi, hogy az oldószert nyomás alkalmazásával visszük át az oszlopon. Így a legtöbb elválasztás kevesebb, mint 20 perc alatt kivitelezhető, és az elválasztás is jobb, mint a hagyományos módszernél. A modern flash kromatográfiás rendszereket előre csomagolt műanyag oszlopként árulják és az oldószert a töltött oszlopon vezetik keresztül. A rendszert detektorokkal vagy frakció szedőkkel bővíthetjük lehetővé téve az automatizálást. A gradiens pumpák bevezetése gyorsabb elválasztást és kisebb oldószer felhasználást eredményezett.
Léteznek olyan segédprogramok a flash kolonnák sikeres fejlesztéséhez, melyek megbecsülik az analitok retenciós térfogatát, a sávok szélességét, az egyes analitokat tartalmazó frakciók számát és a szomszédos csúcsok közötti elválást. Így a felhasználó még a flash kolonna használatba vétele előtt kiválaszthatja a preparatív elválasztáshoz szükséges optimális paramétereket.Fair, J. D.; Kormos, C. M. J. Chromatogr. A 2008, 1211(1-2), 49-54. ()
Az expanded bed adsorption (EBA) az oszlopkromatográfia egy speciális változata, ahol a hagyományos szilárd fázisú töltött oszlop helyett, a oszlopban a szemcsék fluidizált állapotban vannak. Ezáltal lehetséges a kezdeti tisztítási lépések, mint például a centrifugálás és a szűrés elhagyása tenyészetek vagy roncsolt sejtek esetén.
Síkkromatográfia right|thumb|75px|Klorofill komponenseinek elválasztása vékonyréteg kromatográfiával A síkkromatográfia olyan elválasztási technika, ahol az állófázis síkban helyezkedik el vagy sík lemezre viszik fel. Ez a sík lehet papír, melyet önmagában használunk vagy melyet valamilyen anyaggal impregnálva kapjuk az állófázist (papírkromatográfia). A másik lehetőség, hogy szilárd szemcsékből álló réteget viszünk valamilyen hordozóra, például üveglemezre vagy alumínium fóliára (vékonyréteg kromatográfia). A minta elegyben levő különböző vegyületek eltérő távolságra vándorolnak attól függően, hogy milyen erősen kötődnek az állófázishoz a mozgó fázishoz viszonyítva. Az egyes vegyületekre jellemző visszatartási tényező (angolul retardation factor – Rf) segíthet az ismeretlen anyagok azonosításában.
Papírkromatográfia Ennél az eljárásnál egy speciális kromatográfiás papírcsík egyik végére cseppentjük fel a mintaoldatot. A papírcsíkot vékony rétegben oldószert tartalmazó edénybe állítjuk, melyet ezután lefedünk. Ahogy az oldószer végighalad a papíron, áthalad a minta elegyen, amely az oldószerrel együtt vándorolni kezd. A kromatográfiás papír cellulózból készül, ami poláris anyag, így a minta kevésbé poláris komponensei messzebb vándorolnak. A polárisabb vegyületek gyorsabban kötődnek a cellulóz papírhoz, így kevésbé vándorolnak.
Vékonyréteg-kromatográfia (VRK, angolul thin layer chromatography, TLC) A vékonyréteg kromatográfia (VRK) a papírkromatográfiához hasonlító széles körben alkalmazott laboratóriumi eljárás. Állófázisként papír helyett lapos, inert hordozóra felvitt SiO2, Al2O3 vagy cellulóz helyettesíti. Előnye a papírhoz képest a rövidebb futási idő, a jobb elválasztás és a különböző adszorbensek közötti választás lehetősége. Még jobb elválasztás és mennyiségi meghatározás érhető el nagy teljesítményű VRK angolul High Performance Thin Layer Chromatography HPTLC alkalmazásával.
A kromatográfia fajtái a mozgófázis halmazállapota szerint Gázkromatográfia (GC)
A gázkromatográfia (GC), amelyet gáz-folyadék kromatográfiaként (GLC) is emlegetnek, olyan elválasztási technika, melynél a mozgó fázis gáz. A gázkromatográfia tetszőleges halmazállapotú, de az esetek többségében gáz- vagy folyadékminták összetételének meghatározására használt analitikai módszer. A mérés két részből áll: mérés-előkészítésből (ami esetünkben a gázelegy alkotóinak a szétválogatása) és magából a mérésből az érzékelő rendszeren.
A mérés előkészítése során először elkeverik a gázneművé alakított (vagy már gáznemű) mérendő mintát egy másik, semleges gázban, az úgynevezett vivőgázban, mely folyamatosan áramlik egy csövön át. A csőből a keverék olyan „akadálycsőbe”, kolonnába kerül, amelyben nagy felületű anyagot tartalmazó szilárd szemcsék helyezkednek el. Ezek a szilárd szemcsék kettős akadályt képeznek. Egyrészt mozgásukban is, másrészt felületi aktivitásukkal is akadályozzák a beáramló gázelegyet. Az ismeretlen gáz összetevőire különbözőképpen hatnak az akadályok, ezért az ismeretlen gázelegy összetevői más és más mértékben lassulnak le a hosszú akadálycsövön való áthaladás során. Az áthaladás végére így különböző sorrendben érkeznek meg, és egymást követve jutnak az érzékelő rendszerbe. A szétválasztott gázokat ezután többféle detektor (hővezető-képességi, lángionizációs) érzékelheti. A lángionizációs (FID) detektorban a gázt hidrogén és oxigén elegyével táplált lángba vezetik, mely a szerves komponenseket ionizálja, a detektor elektródái között folyó áram arányos az adott komponens koncentrációjával. A detektor jele egy feldolgozó egységbe kerül, mely összeköttetésben áll egy kijelzővel. A kijelzőn ezután megjelenik egy görbe, melynek retenciós ideje az anyag minőségére, amplitúdója az anyag mennyiségére jellemző. A mintabeviteltől (injektálástól) a görbe csúcspontjáig eltelt időt retenciós időnek hívjuk. A pontos mennyiség a görbe alatti terület kiszámításával (integrálásával) határozható meg. Régebbi típusú gázkromatográfoknál a görbét egy toll rajzolta le egy előre megvonalazott papírlapra. Az újabb típusok már számítógéppel vannak összekötve, így a görbe a monitoron is megjelenik.
Néhány kolonna-töltet a 90-es évekből: SP (szilikon-polimer) 3 és 20%-os, Porapak Q.
A kiértékeléshez gyakran használnak tömegspektrométert is.
Folyadékkromatográfia (LC)