Gli interferoni (IFNs) sono una famiglia di citochine (un tipo di proteine) che svolgono un ruolo centrale nella risposta immunitaria alle infezioni virali. Storia
Nel 1957, Alick Isaacs e un post-dottorando svizzero, Jean Lindenmann, stavano studiando il fenomeno dellinterferenza virale, ovvero la capacità di un virus di inibire la replicazione di un altro virus. Quando le membrane corio-allantoidee di embrioni di pollo di 10 giorni venivano infettate con virus dell'influenza inattivati tramite calore o raggi UV, veniva prodotto un materiale che interferiva con la successiva replicazione virale.
La produzione o inibizione del virus influenzale veniva misurata tramite emoagglutinazione, ovvero la capacità del virus di interagire e agglutinare i globuli rossi. Denominarono questa sostanza interferente “interferone”. Il punto finale della titolazione era l'identificazione del pozzetto con agglutinazione parziale. Il reciproco della diluizione influenzale così osservata veniva considerato il titolo dell'interferone.
I primi articoli sull'interferone furono pubblicati nel 1957 nelle prestigiose Proceedings of the Royal Society, e una descrizione più dettagliata apparve sul British Journal of Pathology. Utilizzando tecniche biochimiche standard, venne dimostrato che l'interferone era una proteina, resistente a pH 2, precipitabile con solfato di ammonio, distrutta dall'etere e digerito dalla tripsina. La stabilità a pH 2 era una caratteristica importante, utilizzata in seguito per distinguere l'interferone originale, chiamato IFN-α, dagli altri interferoni scoperti successivamente. I tentativi iniziali di purificare l'interferone fallirono. La sua concentrazione indotta era molto bassa e allora non si sapeva ancora dell'esistenza di molteplici tipi di interferone, così, anche con le tecniche di cromatografia su colonna disponibili all'epoca, si rivelò impossibile purificare un singolo tipo.
Jean Lindenmann tornò a Zurigo e non continuò a lavorare sull'interferone, ma proseguì la ricerca sul virus dell'influenza, scoprendo un ceppo di topi resistente al virus. Questa resistenza non sembrava correlata all'interferone, ma alla proteina Mx, codificata da un gene autosomico, MX. Tuttavia, negli anni successivi, Lindenmann e colleghi scoprirono che la proteina Mx era inducibile dall'interferone e che questa proteina era una componente della cascata di geni indotti dall'interferone.
Piuttosto sorprendentemente, l'interferone non era specifico per il virus. Non solo inibiva l'influenza, ma anche virus non correlati come il vaiolo bovino e altri virus. Il fatto che l'interferone fosse un agente con un range inibitorio molto ampio suggeriva che potesse essere utilizzato come un agente antivirale generale, molto simile agli antibiotici. Di conseguenza, tre aziende farmaceutiche, Glaxo Laboratories, ICI Pharmaceuticals e Burroughs Wellcome, che in seguito sarebbe diventata la Wellwell Foundation, sostennero la ricerca. Lo scopo primario era produrre abbastanza interferone per l'uso in studi clinici, e un secondo obiettivo era mantenere il brevetto per la produzione di interferone nel Regno Unito.
Parallelamente alla ricerca occidentale, ma in modo del tutto indipendente, nel 1954 un gruppo di ricercatori in Giappone identificò ciò che prese il nome di un "fattore inibitore virale". Inocularono il virus del vaiolo vaccino inattivato tramite raggi ultravioletti sul dorso di conigli e successivamente li infettarono con virus del vaiolo vaccino vivo. La replicazione del virus vaccino venne inibita dal pre-trattamento con il virus inattivato. I ricercatori isolarono questa sostanza e la denominarono "fattore inibitorio". Ulteriori esperimenti si rivelarono tuttavia difficili a causa del sistema utilizzato.
Queste osservazioni furono presentate alla riunione annuale del 1956 della Società Giapponese per la Ricerca Virale e successivamente alla riunione della Società di Biologia Giappone-Francia nel 1957. Questo fu, di fatto, il primo rapporto sull'interferone, ma non fu riconosciuto come tale se non molto tempo dopo. Successivamente, l'IF fu testato per l'attività dell'interferone utilizzando l'interferone standard di coniglio, così designato dal Comitato Internazionale sugli Interferoni, e si scoprì che aveva un titolo di interferone di 300.000 UI, un livello di attività sorprendentemente elevato. È ora chiaro che il gruppo giapponese aveva osservato la produzione di interferone in risposta a un virus a DNA inattivato nell'animale intero. Poiché questo lavoro fu condotto in Giappone e originariamente pubblicato su una rivista francese, non ricevette il riconoscimento che meritava.
Nel 1962, fu condotto un ambizioso primo studio clinico presso il Common Cold Center di Salisbury, in Inghilterra. Lo scopo era verificare se l'interferone potesse inibire la produzione del virus del vaiolo vaccino in individui non precedentemente vaccinati, dopo l'iniezione del virus nel braccio. I risultati mostrarono un'inibizione limitata della replicazione virale. Diventò evidente che era necessaria una quantità di interferone molto maggiore per renderlo clinicamente utile, ma solo negli anni '80 fu possibile produrne a sufficienza in uno stato puro.
Prima della clonazione genica, la produzione di interferone in quantità sufficienti per uso clinico era estremamente difficile, anche cercando di produrlo in colture cellulari. Negli anni '60, la domanda di interferone era elevata a causa del suo potenziale come farmaco antitumorale. Kari Cantell, in Finlandia, riuscì a produrre interferone leucocitario in grandi quantità, utilizzando enormi serbatoi e raccogliendo leucociti da diverse fonti per poi infettarli con il virus Sendai, che stimolava notevolmente la produzione di interferone. Tuttavia, anche con queste strutture, era impossibile produrre quantità sufficienti per tutti gli studi clinici desiderati.
Negli anni '60, si scoprì inoltre che molti virus inducevano la produzione di interferone nelle colture cellulari e che, a sua volta, l'interferone aggiunto alle cellule poteva inibire la maggior parte dei virus, soprattutto ad alte concentrazioni. Tuttavia, si comprese molto più tardi che alcuni virus avevano sviluppato meccanismi per neutralizzare la sua attività.
L'interferone veniva misurato in base alla sua attività antivirale: un'unità era sufficiente a inibire la crescita virale del 50%, solitamente tramite un saggio delle placche. Si notò che l'interferone non aveva alcun effetto se aggiunto direttamente al virus. L'inibizione della produzione virale avveniva solo quando l'interferone veniva aggiunto alle cellule. Questo suggeriva che una cellula infettata dal virus produce interferone per proteggere le cellule vicine, mettendole così in uno stato antivirale.
Negli anni '70, vennero caratterizzati diversi tipi di interferone. Furono riscontrate differenze basate sui tipi di cellule protette e sulla stabilità degli interferoni a diversi pH. I primi esperimenti per determinare l'attività antitumorale furono condotti su leucemie murine di origine virale, tra cui la leucemia di Friend e la leucemia di Rauscher. Tuttavia, l'interferone non era attivo solo contro i tumori causati da virus, ma anche contro un gran numero di tumori murini trapiantabili di diverse origini. In questi esperimenti, i tumori venivano iniettati per via intraperitoneale o intramuscolare, in modo che l'interferone potesse essere somministrato direttamente nel tumore. Caratteristiche strutturali e fisiche
Gli interferoni appartengono alla vasta classe di glicoproteine note come citochine. Esistono molti tipi di interferoni, con diversi recettori cellulari e modalità d'azione. Gli interferono vengono classificati in: IFN di tipo I IFN di tipo II o IFN-γ IFN di tipo III o IFN-λ IFN di tipo IV o IFN-u Gli interferoni di tipo I nei mammiferi comprendono almeno 10 sottotipi, tra cui: IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-ω, IFN-κ, IFN-δ, IFN-τ, IFN-ν, IFN-μ e IFN-ζ.
IFN-α
Ognuno ha una sequenza di amminoacidi leggermente diversa, un'attività specifica distinta e uno spettro antivirale differente. I diversi tipi di cellule producono quantità variabili di ciascun tipo e ogni interferone è codificato da un gene distinto. Si sa molto poco sulle basi biologiche delle molteplici specie e delle loro attività, poiché la maggior parte della ricerca è stata condotta solo su uno di questi, denominato IFNα2. L'interferone-alfa viene indotto in diversi tipi di leucociti.
IFN-β
Esiste solo una specie nota di IFN-β, che condivide il 25% di omologia a livello di amminoacidi con IFN-alfa. IFN-β viene prodotto dai fibroblasti e dalle cellule epiteliali in risposta alla presenza di virus e RNA a doppio filamento.
IFN-γ
L'INF-γ viene prodotto dalle cellule del sistema immunitario: cellule dendritiche, cellule NK, linfociti T CD4 e CD8, e macrofagi. L'IFN-γ viene anche indotto da citochine come IL-1, IL-2 e da molti fattori di crescita. Inoltre, è prodotto durante le infezioni virali in vivo come parte del sistema immunitario.
IFN-λ Studi recenti sull'IFN-λ indicano che la sua struttura è simile a quella della famiglia delle interleuchine, in particolare IL-10 e IL-22, e che condivide un recettore comune. L'IFN-λ possiede attività antivirale e potrebbe sostituire l'IFN-α nel trattamento dell'epatite C.
IFN-υ Nel raporto originale sul IFN di tipo IV, l'IFN-υ è stato trovato in una sintenia genica conservata nel pesce zebra (D. rerio), nella rana artigliata (X. laevis), nella lucertola verde di anole (A. carolinensis), nello squalo elefante (C. maximus) e nel pollo (G. gallus). Nelle specie di vertebrati che vanno dai pesci ai mammiferi primitivi, l'IFN-υ differisce dagli IFN di tipo I, II e III per le caratteristiche della sequenza, il locus genico, la filogenesi e il complesso recettoriale. Tuttavia, l'IFN-υ nei pesci è simile agli IFN di tipo I per le loro sequenze C-terminali, e agli IFN di tipo I nei pesci e agli IFN di tipo III nei vertebrati per l'organizzazione a multi-esoni.
Biochimica Tutti gli interferoni agiscono come ligandi di specifici recettori sulla superficie cellulare, stimolando la trascrizione di centinaia di geni i cui prodotti proteici hanno attività antivirale, oltre a effetti antimicrobici, antiproliferativi/antitumorali e immunomodulatori. Gli interferoni inducono centinaia di geni sia in vivo che in vitro, producendo profili genetici sovrapposti e distinti. Il meccanismo di induzione e della risposta antivirale è complesso e coinvolge l'interazione di molte molecole regolatorie.
Gli interferoni non sono indotti solo dai virus, ma anche da intermedi virali come l'RNA a doppio filamento, da RNA sintetici a doppio filamento come il PolyI:PolyC, da alcune specie di batteri, da endotossine e da altre citochine. L'espressione degli interferoni di tipo I e III è indotta in praticamente tutti i tipi cellulari quando vengono riconosciuti schemi molecolari virali, in particolare acidi nucleici, da recettori citoplasmatici ed endosomiali. Al contrario, l'interferone di tipo II è indotto da citochine come l'IL-12 e la sua espressione è limitata alle cellule immunitarie, come le cellule T e le cellule NK.
L'efficacia del sistema degli interferoni nel contrastare le infezioni virali è evidenziata dalla moltitudine di inibitori dell'induzione o dell'azione degli interferoni, codificati da molti virus. Questi inibitori impediscono l'eradicazione dei virus e determinano la continua coesistenza tra virus e vertebrati.
Genetica Sembra che esistano fino a 24 tipi di IFN-α basati sull'omologia genetica, ma solo un tipo di IFN-β. I geni codificanti per i vari interferoni sono i seguenti:
IFN-α cromosoma 9 (9p22) IFN-β cromosoma 9 (9p21) IFN-γ cromosoma 12 (12q14) IFN -λ cromosoma 19 (19q13.13) Gli IFN vengono attivati a livello trascrizionale attraverso una sequenza di eventi di segnalazione altamente orchestrata, composta da sensori virali, proteine adattatrici, chinasi e fattori di trascrizione.