La trascrittomica spaziale () è un insieme di tecnologie che permettono di misurare simultaneamente l'espressione genica e la localizzazione dei trascritti all'interno di sezioni di tessuto. A differenza del sequenziamento dell'RNA in bulk (in inglese bulk RNA-seq), che restituisce una media dell'espressione genica di milioni di cellule, o del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (in inglese scRNA-seq), che analizza singole cellule dopo la dissociazione del tessuto, la trascrittomica spaziale conserva la posizione di ciascuna cellula nel tessuto, permettendo di costruire mappe dell'espressione genica che riflettono l'architettura spaziale del campione.
Le tecnologie di trascrittomica spaziale si suddividono in due grandi famiglie: la trascrittomica spaziale basata sul sequenziamento (sST), che sfrutta il sequenziamento di nuova generazione (in inglese next generation sequencing NGS), e la trascrittomica spaziale basata sull'imaging (iST), che si basa sull'ibridazione fluorescente in situ o sul sequenziamento dell'RNA in situ. Entrambi gli approcci generano una matrice di espressione genica in cui le righe corrispondono ai geni e le colonne alle posizioni spaziali nel tessuto. La sST offre una copertura ampia del trascrittoma a fronte di una risoluzione spaziale più limitata, mentre la iST raggiunge tipicamente una risoluzione spaziale superiore, arrivando fino al livello della singola molecola: le due famiglie sono quindi complementari e si prestano a scenari applicativi distinti.
La trascrittomica spaziale è considerata una componente chiave della biologia spaziale ed è stata nominata Metodo dell'Anno dalla rivista Nature Methods nel 2020. Le sue applicazioni principali riguardano tre domande biologiche: definire la composizione cellulare dei tessuti, studiare le interazioni tra cellule e la loro disposizione spaziale, e mappare le interazioni molecolari attraverso l'analisi delle coppie ligando-recettore.
Contesto e motivazione
La complessità dei tessuti
Gli organismi pluricellulari sono composti da centinaia di tipi cellulari distinti, organizzati in strutture tridimensionali complesse. Il concetto che gli organismi viventi siano costituiti da cellule (teoria cellulare) fu proposto indipendentemente alla fine degli anni 1830 da Matthias Jacob Schleiden per le piante e da Theodor Schwann per gli animali. Da una prospettiva evolutiva, i diversi tipi cellulari si sarebbero sviluppati per consentire una divisione del lavoro, permettendo a cellule differenziate di svolgere compiti distinti con maggiore efficienza.
Se il catalogo dei tipi cellulari e l'organizzazione spaziale di organismi modello relativamente semplici, come il nematode Caenorhabditis elegans, sono oggi ben caratterizzati, comprendere le identità molecolari delle cellule e la loro disposizione tridimensionale in organismi complessi rimane una delle sfide principali della biologia moderna, soprattutto nel contesto di malattie. Molte patologie dipendono infatti dalle proprietà di specifiche popolazioni cellulari in determinati contesti tissutali, rendendo indispensabile la loro caratterizzazione molecolare.
I limiti degli approcci precedenti
I primi tentativi di caratterizzare l'espressione genica si basavano su tecnologie a microarray e sul sequenziamento dell'RNA in bulk. Questi metodi misurano il segnale trascrizionale aggregato di grandi popolazioni cellulari, producendo una media che maschera il contributo dei singoli tipi cellulari e non fornisce nessuna informazione sulla distribuzione spaziale dell'espressione genica nel tessuto.
Lo sviluppo del scRNA-seq ha rappresentato un avanzamento concettuale e tecnico importante, permettendo di sequenziare l'RNA di singole cellule e di rivelare tutta la diversità cellulare presente in tessuti e organi complessi. Tuttavia, il scRNA-seq richiede la dissociazione fisica del tessuto in sospensioni di singole cellule, distruggendo le relazioni spaziali tra di esse. In questo modo, si perdono le informazioni sul contesto in cui ogni cellula si trova: il suo vicinato, la sua prossimità ai vasi sanguigni, ai margini tumorali o agli infiltrati immunitari.
Questa limitazione è particolarmente importante nei contesti in cui l'organizzazione spaziale delle cellule ha un ruolo biologico diretto. All'interno di un tumore, ad esempio, le cellule cancerose al fronte invasivo presentano comportamenti molto diversi da quelle nel nucleo, e le cellule immunitarie svolgono funzioni diverse a seconda di dove si trovano. Comprendere questa eterogeneità spaziale è fondamentale per studiare, ad esempio, il microambiente del tumore.
La trascrittomica spaziale come soluzione
La trascrittomica spaziale nasce come risposta a questa sfida, permettendo di quantificare l'RNA mantenendo il contesto spaziale dell'espressione genica all'interno di sezioni di tessuto intatto. Combinando espressione genica e informazioni posizionali, questi metodi consentono di ricostruire l'architettura molecolare dei tessuti, identificare popolazioni cellulari con una specifica distribuzione spaziale e studiare come le cellule comunicano tra loro all'interno del tessuto.
Storia
Origini: l'ibridazione in situ
Le radici concettuali della trascrittomica spaziale risiedono nello sviluppo dell'ibridazione in situ (ISH), tecnica descritta per la prima volta nel 1969. Joseph G. Gall e Mary-Lou Pardue mostrarono che molecole di RNA marcate radioattivamente potevano ibridarsi con sequenze di DNA complementari all'interno di preparati citologici di oocita di Xenopus laevis (rana artigliata), permettendo la localizzazione spaziale di specifiche sequenze genomiche. Si stabiliva così il principio che le sequenze di acidi nucleici possono essere rilevate in situ, nel loro contesto tissutale originale. Tuttavia, il metodo era limitato alla rilevazione di un gene per volta e la marcatura radioattiva ne rendeva l'applicazione lenta e tecnologicamente impegnativa, precludendo qualsiasi analisi su scala trascrittomica.
Un avanzamento importante si ebbe nel 1998, con lo sviluppo dell'ibridazione in situ a singola molecola con fluorescenza (smFISH), che permise per la prima volta di contare singoli trascritti nella loro precisa posizione subcellulare.
Gli anni dopo il 2010 furono caratterizzati da nuovi metodi basati sull'imaging che superarono progressivamente i limiti di copertura genica dell'ISH classica. RNAscope (2012) introdusse coppie di sonde a forma di Z capaci di amplificare il segnale riducendo drasticamente il rumore di fondo, rendendo possibile la rilevazione di singole molecole di RNA anche in tessuto d'archivio. Il problema della copertura genica fu affrontato da un gruppo di metodi basati sulla codifica molecolare. La fluorescenza in situ sequenziale (seqFISH, 2014) estese la capacità di analisi simultanea dei geni assegnando a ciascuno un codice a colori univoco attraverso cicli successivi di ibridazione. La MERFISH (2015) ampliò ulteriormente questo approccio codificando ciascun trascritto con un codice binario attraverso cicli multipli di ibridazione. Entrambi gli approcci si scontrarono però con il problema dell'affollamento ottico nei tessuti ad alta densità cellulare: la osmFISH (2018) propose una soluzione sequenziando un trascritto alla volta prima di rimuovere la sonda. La seqFISH+ (2019) rappresentò infine il culmine di questa traiettoria, permettendo di rilevare simultaneamente fino a 10.000 geni con risoluzione a singola cellula.
In parallelo, gli approcci basati sulla microdissezione fornirono un primo collegamento tra l'analisi spaziale del tessuto e il sequenziamento dell'RNA. La microdissezione a cattura laser (LCM) fu sviluppata alla fine degli anni 1990: sfrutta un raggio laser per isolare fisicamente regioni o popolazioni cellulari specifiche da una sezione di tessuto, consentendo il successivo sequenziamento del materiale isolato. Un approccio alternativo, basato sul criosezionamento del tessuto in fette micrometriche anziché sull'isolamento laser, permise nel 2013 di ottenere per la prima volta mappe di espressione genica su scala genomica in embrioni di Drosophila (moscerino della frutta).
Concetti precoci di genomica spaziale
Il concetto di indicizzazione spaziale dell'attività genomica fu esplorato già negli anni 1990 attraverso il Visible Embryo Project, che descrisse un metodo denominato Spatial Analysis of Genomic Activity (SAGA), volto a ricostruire i pattern di espressione genica nello spazio tridimensionale dei tessuti embrionali. Pur non raggiungendo un'ampia diffusione, questo lavoro anticipò molti dei principi concettuali del campo moderno.
La rivoluzione del 2016
L'avanzamento decisivo si ebbe nel 2016, quando Patrik Ståhl, Joakim Lundeberg, Jonas Frisén e colleghi del Karolinska Institut di Stoccolma pubblicarono su Science un metodo che per la prima volta combinava la cattura di mRNA con localizzazione spaziale e il sequenziamento di nuova generazione su scala trascrittomica. In questo approccio, le sezioni di tessuto venivano appoggiate su vetrini rivestiti di sonde oligonucleotidiche con codici a barre associati alla posizione spaziale, permettendo di assegnare a ciascun trascritto rilevato una coordinata bidimensionale all'interno del tessuto. Gli autori coniarono il termine "spatial transcriptomics" e il lavoro è considerato la pubblicazione di riferimento del campo moderno. La tecnologia fu commercializzata attraverso la società Spatial Transcriptomics, acquisita da 10x Genomics nel 2018.
Commercializzazione ed espansione (2019-presente)
Il campo accelerò rapidamente con il lancio commerciale di piattaforme dedicate nel 2019. NanoString Technologies introdusse il GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP), mentre 10x Genomics lanciò la piattaforma Visium, rendendo la trascrittomica spaziale basata su array ampiamente accessibile. Nello stesso anno, i laboratori di Fei Chen ed Evan Macosko al Broad Institute svilupparono Slide-seq, un approccio complementare basato su sfere con codici a barre che raggiunge una risoluzione spaziale prossima alla singola cellula.
Nature Methods nominò la trascrittomica spaziale Metodo dell'Anno per il 2020. Gli anni successivi videro l'introduzione di piattaforme sempre più avanzate, tra cui Visium HD e Xenium (10x Genomics) e CosMx SMI (NanoString), e la crescita di un ecosistema di strumenti computazionali per l'analisi dei dati spaziali.
Tecnologie
Il concetto base
Tutti i metodi di trascrittomica spaziale condividono un obiettivo comune: associare ciascuna molecola di RNA rilevata a una posizione fisica nel tessuto, producendo una mappa dell'espressione genica che ne preserva l'architettura. Indipendentemente dalla tecnologia usata, il risultato principale è lo stesso: una matrice di espressione genica in cui ogni valore indica l'abbondanza di un dato trascritto in una data posizione, accompagnata da un'immagine del tessuto che fornisce il contesto morfologico.
Panoramica delle tecnologie
I metodi di trascrittomica spaziale si suddividono in tre grandi categorie, ciascuna con una strategia diversa per collegare l'identità del trascritto alla sua posizione nel tessuto.