Виртуелен кариотип ― дигитална информација што одразува кариотип, што произлегува од анализата на кратки секвенци на ДНК од специфични места низ целиот геном, кои се изолирани и набројани.Digital karyotyping - Wang et al., 10.1073/pnas.202610899 - Proceedings of the National Academy of Sciences Открива варијации на бројот на геномски копии со повисока резолуција за ниво од конвенционалната кариотипизација или споредбената геномска хибридизација засновата на хромозом. Главните методи што се користени за создавање виртуелни кариотипови се низа на споредбената геномска хибридизација и низа на единечно нуклетидниот полиморфизам.
Заднина Кариотипот (слика 1) е карактеристичниот хромозомски комплемент на еден еукариотски вид.White M.J.D. 1973. The chromosomes. 6th ed, Chapman & Hall, London. p28Stebbins G.L. 1950. Variation and evolution in plants. Chapter XII: The Karyotype. Columbia University Press N.Y. Кариотипот обично се прикажуван како слика на хромозомите од една единствена клетка распоредена од најголем (хромозом 1) до најмал (хромозом 22), а последни се прикажани половите хромозоми (X и Y). Историски гледано, кариотиповите се добивани со боење на клетките откако тие биле хемиски прекинати за време на клеточната делба. Кариотиповите се користени неколку децении за да бидат идентификувани хромозомските абнормалности и во микробните и во ракородните клетки. Конвенционалните кариотипови можат да го проценат целиот геном за промени во структурата и бројот на хромозомите, но резолуцијата е релативно груба, со ограничување за откривање од 5-10 Mb. мини|250x250пкс| Слика 1. Кариотип на човек маж кој користи Гимзово боење.
Метод Неодамна, биле појавени платформи за создавање кариотипови, правени на сметач и со висока резолуција од нарушена ДНК, како што се низа на споредбена геномска хибридизација и низа на единечна нуклеотидна полиморфизам. Концептуално, низите се составени од стотици до милиони сонди кои се комплементарни на регионот од интерес во геномот. Нарушената ДНК од тест примерокот е расцепкана, означена и хибридизирана во низата. Интензитетот на сигналот за хибридизација за секоја сонда е користен од специјализиран софтвер за да биде направен log2 соодносен од примерок и контрола за секоја сонда на низата.
Знаејќи ја местоположбата на секоја сонда на низата и местоположбата на секоја сонда во геномот, софтверот ги подредува сондите во хромозомски редослед и го реконструира геномот дигитално (слика 2).
Виртуелните кариотипови имаат драматично повисока резолуција од конвенционалната цитогенетика. Вистинската резолуција ќе зависи од густината на сондите на низата. Во моментов, Affymetrix SNP6.0 е комерцијално достапна низа со најголема густина за применувања за виртуелна кариотипизација. Содржи 1,8 милиони полиморфни и неполиморфни маркери за практична резолуција од 10–20 kb - приближно со големина на ген. Ова е приближно 1000 пати поголема резолуција од кариотиповите добиени од конвенционалната цитогенетика.
Виртуелните кариотипови може да бидат изведени на примероци од микробната линија за конституционални нарушувања, и клиничкото тестирање е достапно од десетици лаборатории сертифицирани со CLIA (genetests.org). Виртуелна кариотипизација може да биде направена и на свежи или формалинско фиксирани парафински тумори. Лабораториите кои се сертифицирани со CLIA, кои нудат тестирање на тумори се Creighton Medical Laboratories (свежи и парафински вградени примероци на тумор) и CombiMatrix Molecular Diagnostics (свежи примероци на тумор). мини| Слика 2. Виртуелен кариотип log2 соодносен преглед на примерок од хронична лимфоцитна леукемија со помош на низа на единечен нуклеотиден полиформизам. Жолта = број на копија од 2 (нормална/диплоидна), аква = 1 (бришење), розова = 3 (трисомија).
Различни платформи за виртуелно кариотипирање Кариотипизацијата заснована на низа може да се направи со неколку различни платформи, и лабораториски развиени и комерцијални. Самите низи можат да бидат ширум геномот (сонди распространети низ целиот геном) или насочени (сонди за геномски региони за кои е познато дека се вклучени во одредена болест) или комбинација од двете. Понатаму, низите што се користени за кариотипизација може да користат неполиморфни сонди, полиморфни сонди (т.е. што содржат единечен нуклеотиден полиформизам) или комбинација од двете. Неполиморфните сонди можат да обезбедат само информации за бројот на копијата, додека низите на единечен нуклеотиден полиформизам можат да обезбедат и број на копии и статус на загуба на хетерозиготност во една анализа. Врстите на сонди кои се користени за неполиморфни низи се копирана, клонови на бактериски вештачки хромозоми (на пр. BlueGnome ) и олигонуклеотиди (на пример, Agilent, Санта Клара, Калифорнија, Соединетите Држави или Nimblegen, Медисон, Висконсин, Соединетите Држави). Комерцијално достапните олигонуклеотидни низи на единечниот нуклеотиден полиформизам можат да бидат со цврста фаза (Affymetrix, Санта Клара, Калифорнија) или врз основа на монистра (Illumina, Сан Диего, Калифорнија). И покрај разновидноста на платформите, на крајот сите тие користат геномска ДНК од нарушените клетки за да создадат дигитален кариотип со висока резолуција. Крајниот производ сè уште нема доследно име и е наречен виртуелно кариотипирање, дигитално кариотипирање, молекуларна алелокариотипизација, и молекуларна кариотипизација. Други поими што се користени за опишување на низите што се користат за кариотипизација вклучуваат олигонуклеотидни микрочипови со единечен нуклеотиден полиформизам и хромозомски микрочип. Некои сметаат дека сите платформи се вид на низи на споредбена геномска хибридизација, додека други го задржуваат тој поим за методите со две бои, а трети ги издвојуваат низите на единечен нуклеотиден полиформизам бидејќи тие создаваат повеќе и различни информации од методите со двобојна низа на споредбената гемонска хибридизација.
Примени
Откривање на промени во бројот на копии Промените на бројот на копии може да се видат и во примероците од микробните и туморските примероци. Промените на бројот на копии може да бидат забележани со низи со неполиморфни сонди, како што е низа на споредбената геномска хибридизација, и со низи засновани на единечниот нуклеотиден полиформизам. Луѓето се диплоидни, така што нормалниот број на копии е секогаш два за неполовите хромозоми.
Бришење: Бришење е губење на генетски материјал. Бришењето може да биде хетерозиготно (копија број 1) или хомозиготно (копија број 0, нулисомија). Микроделеционите синдроми се примери на конституционални нарушувања поради мали бришења во ДНК на микробната линија. Бришењето во клетките на туморот може да претставува исклучување на туморски потиснувачки ген и може да има дијагностички, прогностички или терапевтски последици. Добивки: добивката на бројот на копијата ја претставува добивката на генетскиот материјал. Ако добивката е од само една дополнителна копија на сегмент од ДНК, тоа може да биде наречено удвојување (сл. 3). Ако има една дополнителна копија од цел хромозом, тоа може да биде наречено трисомија. Зголемувањето на бројот на копии во примероците од микробната линија може да биде поврзано со болеста или може да биде бенигна варијанта на бројот на копии. Кога се гледани во клетките на туморот, тие може да имаат дијагностички, прогностички или терапевтски последици.
мини|306x306пкс| Слика 3. Шема на регионот на хромозомот пред и по настанот на удвојување.
Засилувања: Технички, засилувањето е тип на зголемување на бројот на копијата во која има број на копирање >10. Во контекст на биологијата на ракот, често се забележувани засилувања кај онкогените. Ова може да укаже на полоша прогноза, да помогне да се категоризира туморот или да укаже на подобност за лекови. Пример за подобност на лекот е засилувањето Her2Neu и Herceptin, а дадена е слика на засилување Her2Neu откриена со виртуелно кариотипирање на низата на единечен нуклеотиден полиформизам (сл. 4).мини|Слика 4. Засилувањео со Her2 со низа на единечен нуклеотиден полиформизам од виртуелен кариотип.
Губење на хетерозиготност, автозиготни сегменти и еднородителска дисомија Автозиготните сегменти и еднородителната дисомија се диплоидни/„кописко неутрални“ генетски наоди и затоа се забележувани само со низи засновани на единечен нуклеотиден полиформизам. И автозиготните сегменти и еднородителската дисомија ќе покажат губење на хетерозиготност со број на копии од два со кариотипирање на низата на единечниот нуклеотиден полиформизам. Поимот истеци на хомозгиготност (Runs of Homozgygosity) е општи поим кој може да биде користен или за автозиготни сегменти или за еднородителска дисомија.
Автозиготен сегмент: Автозиготниот сегмент е двородител и е гледан само во микробната линија. Тие се продолжени низи на хомозиготни маркери во геномот и се појавуваат кога идентичен хаплотипски блок е наследен од двата родители. Тие се нарекувани и сегменти „идентични по потекло“ и можат да бидат користени за картирање на хомозиготноста. Еднородителска дисомија: Еднородителската дисомија се јавува кога двете копии на ген или геномски регион се наследени од истиот родител. Ова е еднородителско, за разлика од автозиготните сегменти кои се двородителски. Кога се присутни во микробната линија, тие можат да бидат безопасни или поврзани со болести, како што се Прадер-Вилиевиот или Ангелмановиот синдром. Исто така, за разлика од автозиготноста, еднородителската дисомија може да биде развиена во клетките на туморот, и тоа е нарекувано во книжевноста како стекната еднородителска дисомија или копирање неутрална загуба на хетерозиготност. Стекнатата еднородителска дисомија е доста честа појава и кај хематолошките и кај цврстите тумори и е пријавено дека сочинува 20 до 80% од загубата на хетерозиготност забележан кај човечките тумори. Стекнатата еднородителска дисомија може да послужи како втор погодок во Кнадсоновата хипотеза за туморска генеза со два погодоци, и на тој начин може да биде биолошки еквивалент на бришење. Бидејќи оваа врста на лезија не може да се открие со низата на споредбената геномска хибридизација, флуоресцентната „на лице место“ хибридизација или конвенционална цитогенетика, се претпочитаат низи засновани на единечен нуклеотиден полиформизам за виртуелна кариотипизација на туморите.
Примери на клинички примени против рак Виртуелен кариотип може да биде создаден од речиси секој тумор, но клиничкото значење на идентификуваните геномски аберации се различни за секој вид на тумор. Клиничката корист варира и соодветноста најдобро ја одредува онколог или патолог во советување со лабораторискиот директор на лабораторијата што го изведува виртуелниот кариотип. Подолу се дадени примери на типови на рак каде клиничките последици на специфичните геномски аберации се добро утврдени. Овој список е претставителен, не е исцрпувачки. Мрежната страница на Лабораторијата за цитогенетика во Државната лабораторија за хигиена во Висконсин има дополнителни примери на клинички релевантни генетски промени кои лесно се откривамо со виртуелна кариотипизација.
Невробластом Врз основа на серија од 493 примероци на невробластом, објавено е дека севкупниот геномски модел, како што е тестиран со кариотипизација заснован на низа, е претскажувач за исходот кај невробластомот:
Туморите кои се манифестирале исклучиво со промени на бројот на копии на цела хромозом биле поврзани со одлично преживување. Туморите кои се манифестираат со било каков вид на промени на бројот на копијата на сегменталниот хромозом биле поврзани со висок ризик од релапс. Во рамките на туморите кои покажуваат сегментални промени, дополнителни независни предиктори за намаленото вкупно преживување биле засилување со генот MYCN, бришења на 1p и 11q, и добивање на 1q.
Претходните публикации ги категоризирале невробластомите во три главни подвидови врз основа на цитогенетските профили:
Подвид 1: поволен невробластом со речиси триплоидија и доминација на бројчани добивки и загуби, кои претежно претставуваат неметастатски невробластомски фази 1, 2 и 4S.