Flavínadeníndinukleotid (FAD) je redoxne aktívny koenzým spojený s rôznymi bielkovinami, ktorý sa podieľa na niekoľkých enzymatických reakciách v metabolizme. Flavoproteíny sú bielkoviny, ktoré obsahujú flavínovú skupinu, ktorá môže byť vo forme FAD alebo flavínmononukleotidu (FMN). Je známych veľa flavoproteínov, napríklad časti komplexu sukcinátdehydrogenázy, α-ketoglutarátdehydrogenáza alebo jedna z častí komplexu pyruvátdehydrogenázy.
FAD sa môže vyskytovať v štyroch redoxných stavoch, ktorými sú flavín-N(5)-oxid, chinón, semichinón a hydrochinón. FAD prechádza medzi týmito stavmi prijatím alebo darovaním elektrónov. FAD vo svojej úplne oxidovanej forme alebo vo forme chinónu prijíma dva elektróny a dva protóny (ióny H+), čím sa z neho stáva FADH2 (hydrochinónová forma). Semichinón (FADH•) môže vzniknúť buď redukciou FAD alebo oxidáciou FADH2, v oboch prípadoch prijatím alebo darovaním jedného elektrónu a jedného protónu. Niektoré proteíny ho však vytvárajú a udržiavajú v podobe flavín-N(5)-oxidu.
História Flavoproteíny boli prvýkrát objavené v roku 1879 oddelením zložiek kravského mlieka. Pre ich mliečny pôvod a žltý pigment sa spočiatku nazývali laktochrómy. Trvalo 50 rokov, kým vedecká komunita urobila zásadný pokrok v identifikácii molekúl zodpovedných za žltý pigment. 30. roky 20. storočia odštartovali oblasť výskumu koenzýmov publikovaním mnohých štruktúr flavínových a nikotínamidových derivátov a ich významných úloh v redoxnej katalýze. Nemeckí vedci Otto Warburg a Walter Christian objavili v roku 1932 žltý proteín z kvasiniek potrebný na bunkové dýchanie. Ich kolega Hugo Theorell rozdelil tento žltý enzým na apoenzým a žltý pigment a ukázal, že ani enzým, ani pigment nie sú schopné samostatne oxidovať NADH, ale ich zmiešaním sa aktivita obnovila. Theorell v roku 1937 potvrdil, že pigmentom je fosfátový ester riboflavínu, flavínmononukleotid (FMN), čo bol prvý priamy dôkaz enzýmových kofaktorov. Warburg a Christian potom podobnými experimentmi v roku 1938 zistili, že FAD je kofaktorom oxidázy D-aminokyselín. Warburgova práca, ktorá prepojila nikotínamid s prenosom hydridu a objav flavínov, vydláždili cestu mnohým vedcom v 40. a 50. rokoch, kedy bolo objavené veľké množstvo redoxnej biochémie a tieto reakcie boli spojené v dráhach, ako sú citrátový cyklus a syntéza ATP.
Vlastnosti FAD pozostáva z dvoch častí: adenínového nukleotidu (adenozínmonofosfátu) a flavínmononukleotidu (FMN), ktoré sú navzájom premostené prostredníctvom svojich fosfátových skupín. Adenín je naviazaný na cyklickú ribózu na 1' uhlíku, zatiaľ čo fosfát je naviazaný na ribózu na 5' uhlíku za vzniku adenínového nukleotidu. Riboflavín je tvorený väzbou uhlík-dusík (CN) medzi flavínom (modifikovaným izoaloxazínom) a ribitolom. Fosfátová skupina je potom naviazaná na koncový uhlík ribózy, čím vzniká FMN. Pretože väzba medzi izoaloxazínom a ribitolom sa nepovažuje za glykozidovú väzbu, flavínmononukleotid nie je skutočným nukleotidom. Názov dinukleotid je teda zavádzajúci, avšak flavínmononukleotidová skupina je svojou štruktúrou a chemickými vlastnosťami stále veľmi blízka nukleotidu. vľavo|náhľad|422x422bod|Premena FAD na FADH2 FAD možno redukovať na FADH2 pridaním 2 H+ a 2 e -. FADH2 sa potom môže oxidovať aj stratou 1 H + a 1 e − za vzniku FADH. Ďalšou stratou 1 H+ a 1 e- môže byť obnovený FAD. K tvorbe FAD môže dôjsť aj redukciou a dehydratáciou flavín-N(5)-oxidu. Na základe oxidačného stavu získavajú flavíny vo vodnom roztoku špecifické farby. Flavín-N(5)-oxidová forma je žltooranžová, FAD (oxidovaná forma) je žltý, FADH (poloredukovaný) je buď modrý alebo červený podľa pH a FADH2 (úplne redukovaná forma) je bezfarebný. Zmena formy môže mať veľký vplyv na ďalšie chemické vlastnosti. Napríklad FAD, plne oxidovaná forma, podlieha nukleofilnému ataku, zatiaľ čo plne redukovaná forma, FADH2, má vysokú polarizovateľnosť a polovične redukovaná forma, FADH, je vo vodnom roztoku nestabilná. FAD je aromatický kruhový systém, zatiaľ čo FADH2 nie je. To znamená, že FADH2 má výrazne vyššiu energiu bez stabilizácie prostredníctvom rezonancie, ktorú poskytuje aromatická štruktúra. FADH2 je teda molekula nesúca energiu, pretože po oxidácii znovu získava aromatickosť a uvoľňuje energiu reprezentovanú touto stabilizáciou. náhľad|Približné absorpčné spektrum FAD Spektroskopické vlastnosti FAD a jeho variantov umožňujú sledovanie reakcií pomocou UV-Vis absorpčnej a fluorescenčnej spektroskopie. Každá forma FAD má odlišné absorpčné spektrum, čo uľahčuje pozorovanie zmien v oxidačnom stave. Hlavné lokálne maximum absorpcie pre FAD je pozorované pri 450 nm s absorpčným koeficientom 11 300 M −1 cm −1. Flavíny majú vo všeobecnosti fluorescenčnú aktivitu, keď nie sú viazané na bielkoviny (proteíny naviazané na deriváty flavínových nukleotidov sa nazývajú flavoproteíny). Túto vlastnosť možno využiť pri skúmaní proteínovej väzby, pretože možno sledovať stratu fluorescencie, keď sa flavíny naviažu na bielkovinu. Oxidované flavíny majú vysoké absorbancie okolo 450 nm a fluoreskujú pri asi 515-520 nm.
Chemické stavy V biologických systémoch pôsobí FAD ako akceptor H+ a e− v jeho plne oxidovanej forme, ako akceptor alebo donor vo forme FADH a ako donor v redukovanej forme FADH2. Nižšie uvedený diagram sumarizuje redoxné zmeny, ktorými môže FAD prejsť. stred|náhľad|500x500bod|Redoxné stavy FAD: flavín-N(5)-oxid, chinónová forma, semichinónová forma a hydrochinónová forma. Okrem toho môžu vznikať a reagovať ďalšie reaktívne formy FAD. Tieto reakcie zahŕňajú prenos elektrónov a vznik/zánik chemických väzieb. FAD je schopný prispievať k chemickým reakciám v rámci biologických systémov ako súčasť rôznych reakčných mechanizmov. Nasledujúce obrázky zobrazujú všeobecné podoby niektorých reakcií, do ktorých sa môže FAD zapojiť.
Mechanizmy 1 a 2 predstavujú príjem hydridu, pri ktorom molekula prijíma v procese jeden hydridový anión, a to v podobe vodíkového katiónu a dvoch elektrónov. Mechanizmy 3 a 4 predstavujú tvorbu radikálov a stratu hydridu. Radikály obsahujú atómy s nepárovými elektrónmi a sú veľmi (re)aktívne. Strata hydridu je opačný proces k vyššie popísanému príjmu hydridu. Mechanizmy 5 a 6 ukazujú nukleofilnú adíciu a reakciu využívajúcu uhlíkový radikál. vľavo|náhľad|400x400bod|Mechanizmus 1. K príjmu hydridu dochádza príjmom H+ a 2 e-vpravo|náhľad|400x400bod|Mechanizmus 2. Prenos hydridu abstrakciou hydridu z NADHvľavo|náhľad|400x400bod|Mechanizmus 3. Vznik radikálu abstrakciou elektrónovvpravo|náhľad|400x400bod|Mechanizmus 4. Strata hydridu, ktorý prijíma elektróndeficitná skupina Rvľavo|náhľad|400x400bod|Mechanizmus 5. Prerušenie väzby R1-R2 po nukleofilnej adíciináhľad|410x410bod|Mechanizmus 6. Uhlíkový radikál reaguje s O2 a kyselinou za vzniku peroxidu vodíka
Biosyntéza FAD hrá hlavnú úlohu ako enzýmový kofaktor spolu s flavínmononukleotidom (FMN), ďalšou molekulou odvodenou od riboflavínu. Baktérie, huby a rastliny vedia produkovať riboflavín, ale iné eukaryoty, ako napríklad ľudia, stratili schopnosť ho syntetizovať. Preto ľudia musia získavať riboflavín, tiež známy ako vitamín B2, zo zdrojov potravy. Riboflavín sa vo všeobecnosti prijíma v tenkom čreve a potom sa presúva do buniek prostredníctvom nosných proteínov. Riboflavínkináza (EC 2.7.1.26) pridáva fosfátovú skupinu k riboflavínu za vzniku FMN a potom naňho FAD syntetáza pripája adenínový nukleotid za vzniku FAD, pričom oba kroky vyžadujú ATP. Baktérie majú vo všeobecnosti jeden bifunkčný enzým, ale archeóny a eukaryoty zvyčajne používajú dva odlišné enzýmy. Súčasný výskum naznačuje, že v cytosóle a mitochondriách existujú odlišné izoformy. Zdá sa, že FAD je syntetizovaný na oboch miestach a potenciálne transportovaný tam, kde je to potrebný. stred|náhľad|550x550bod|Biosyntéza FAD z riboflavínu
Funkcia Flavoproteíny využívajú jedinečnú a všestrannú štruktúru flavínových skupín na katalýzu náročných redoxných reakcií. Keďže flavíny majú viacero redoxných stavov, môžu sa podieľať na procesoch, ktoré zahŕňajú prenos jedného alebo dvoch elektrónov, atómov vodíka alebo iónov H3O+. N5 a C4a plne oxidovaného flavínového kruhu sú tiež náchylné na nukleofilný útok. Túto širokú škálu stavov ionizácie a modifikácie flavínovej časti možno pripísať izoaloxazínovému kruhovému systému a schopnosti flavoproteínov drasticky narušiť kinetické parametre flavínov, vrátane flavínadeníndinukleotidu (FAD), po naviazaní.
Počet flavoproteínov kódovaných v genóme (flavoproteóm) je závislý na konkrétnom druhu a môže sa pohybovať od 0,1 % do 3,5 %, pričom ľudia majú 90 génov, ktoré kódujú flavoproteíny. FAD je komplexnejšia a hojnejšia forma flavínu a uvádza sa, že sa viaže na 75 % celkového flavoproteómu a 84 % ľudských kódovaných flavoproteínov. Bunkové koncentrácie voľných alebo nekovalentne viazaných flavínov v rôznych kultivovaných cicavčích bunkových líniách boli stanovené pre FAD (2,2-17,0 amol/bunka) a FMN (0,46-3,4 amol/bunka).
FAD má pozitívnejší redukčný potenciál ako NAD+ a je to veľmi silné oxidačné činidlo. Bunky ho využívajú pri mnohých energeticky náročných oxidačných reakciách, napríklad dehydrogenácii C–C väzby za vzniku alkénu. Proteíny využívajúce FAD fungujú vo veľkom množstve metabolických dráh vrátane transportu elektrónov, opravy DNA, biosyntézy nukleotidov, beta-oxidácie mastných kyselín, katabolizmu aminokyselín, ako aj syntézy ďalších kofaktorov, ako sú CoA, CoQ a hemových skupín. Jedna zo známejších reakcií je súčasťou citrátového cyklu – sukcinátdehydrogenáza (komplex II v elektrónovom transportnom reťazci) vyžaduje kovalentne naviazaný FAD, aby mohla katalyzovať oxidáciu sukcinátu na fumarát, ktorá je spriahnutá s redukciou ubichinónu na ubichinol. Vysokoenergetické elektróny z tejto oxidácie sa na chvíľu uložia do redukovaného FADH2. FADH2 sa potom vráti do podoby FAD a presúva svoje dva vysokoenergetické elektróny cez elektrónový transportný reťazec, pričom energia uložená v FADH2 postačuje na výrobu 1,5 ekvivalentu ATP oxidačnou fosforyláciou. Niektoré redoxné flavoproteíny viažu FAD nekovalentne, ako napríklad acetyl-CoA-dehydrogenázy, ktoré sa podieľajú na beta-oxidácii mastných kyselín a katabolizme aminokyselín, ako sú leucín (izovaleryl-CoA dehydrogenáza), izoleucín (dehydrogenáza acyl-CoA s krátkym/rozvetveným reťazcom), valín (izobutyryl-CoA dehydrogenáza) a lyzín (glutaryl-CoA dehydrogenáza). Ďalšími príkladmi enzýmov využívajúcich FAD, ktoré regulujú metabolizmus, sú glycerol-3-fosfátdehydrogenáza (syntéza triglyceridov) a xantínoxidáza, ktorá sa podieľa na katabolizme purínových nukleotidov. Nekatalytické funkcie, ktoré môže hrať FAD vo flavoproteínoch, zahŕňajú štruktúrne úlohy alebo sa podieľa na funkcii fotoreceptorov citlivých na modré svetlo, ktoré regulujú biologické hodiny a vývoj a generovanie svetla v bioluminiscenčných baktériách.
Flavoproteíny Flavoproteíny majú ako prostetickú skupinu molekulu FMN alebo FAD. Táto prostetická skupina môže byť viazaná kovalentne alebo nekovalentne. Len asi 5-10% flavoproteínov má FAD viazaný kovalentne, ale tieto enzýmy majú väčšiu redoxnú silu. V niektorých prípadoch môže FAD poskytnúť štruktúrnu oporu pre aktívne miesta enzýmov alebo poskytnúť stabilizáciu medziproduktov počas katalýzy. Na základe dostupných štruktúrnych údajov možno známe miesta viažuce FAD rozdeliť na viac ako 200 typov.
V ľudskom genóme je kódovaných 90 flavoproteínov; asi 84 % vyžaduje FAD a zvyšných asi 16 % vyžaduje FMN, zatiaľ čo 5 proteínov vyžaduje prítomnosť oboch. Flavoproteíny sa nachádzajú hlavne v mitochondriách kvôli ich redoxnej sile. Spomedzi všetkých flavoproteínov, 90 % katalyzuje redoxné reakcie a zvyšných 10 % sú transferázy, lyázy, izomerázy a ligázy.
Oxidácia väzieb uhlík-heteroatóm
Uhlík-dusík