TCEP je redukčné činidlo, ktoré sa často používa v biochémii a molekulárnej biológii. Často sa pripravuje a používa v podobe chloridovej soli (TCEP-HCl). TCEP je rozpustný vo vode a dostupný v podobne stabilizovaného roztoku s neutrálnym pH alebo imobilizovaný na agarózovom géli, čo uľahčuje odstránenie činidla.
TCEP transformuje elektrofilnú disulfidovú funkčnú skupinu na dve nukleofilné tiolové skupiny. Reakcia je hnaná dopredu svojím exergonickým priebehom kvôli tvorbe silnej a pevnej dvojitej väzby P=O.
Reakcie TCEP sa používa na redukciu disulfidických väzieb v bielkovinách:
Okrem toho bolo opísaných niekoľko ďalších reakcií:
premena cysteínových bočných reťazcov na alanín v prítomnosti TCEP a vysokej teploty (90 °C) pomalé štiepenie peptidových väzieb v bielkovinách u cysteínových reziduí pri miernych podmienkach (reakcia je pomalá, ale prebieha vo významnom množstve, po dvoch týždňoch skladovania pri 4 °C sa rozštiepilo až 40 % väzieb)
Použitie TCEP sa používa na štiepenie disulfidických väzieb, intra- i intermolekulárnych, v prípavných krokov pre gélovú elektroforézu.
TCEP sa používa na redukciu disulfidových mostíkov protilátok pri príprave konjugátov protilátok a liečiv (ADC, ang. antibody-drug conjugates).
V porovnaní s najbežnejšími činidlami používanými na tieto účely, ditiotreitolom a merkaptoetanolom, má TCEP niekoľko výhod: nemá žiadny zápach, je silnejším redukčným činidlom, oxiduje sa nevratne, pretože vznik dvojitej väzby P=O je silno exergonický, produktom štiepenia sú dve voľné tiolové skupiny, je hydrofilnejší vďaka prítomným karboxylovým skupinám, a odolnejší voči oxidácii na vzduchu.TCEP technical information, from Interchim Takisto neredukuje ióny kovov, ktoré sa používajú v imobilizovanej kovovej afinitnej chromatografii.
TCEP je obzvlášť užitočný pri označovaní cysteínových reziduí pomocou maleimidov. TCEP je schopný udržať voľné tiolové skupiny na cysteínoch a, na rozdiel od ditiotreitolu a merkaptoetanolu, nereaguje okamžite s maleimidom. Boli však opísané i reakcie TCEP s maleimidom za istých podmienok.
TCEP možno použiť i pri homogenizácii tkaniva pri izolácii RNA.
TCEP má takisto tú výhodu, že pri použíti UV-Vis spektroskopie neabsorbuje v rozmedzí 250 až 285 nm, na rozdiel od ditiotreitolu, takže ho možno použiť i pri stanoveniach prebiehajúcich pri týchto vlnových dĺžkach. Ditiotreitol v tomto rozmedzí vlnových dĺžok absorbuje stále viac a viac žiarenia, pretože sa v čase oxiduje rôznymi reakciami.
Biologický výskum TCEP je dostupný od mnohých výrobcov v podobe chloridovej soli (s HCl). Po rozpustení TCEP-HCl vo vode vzniká kyslý roztok. Typicky sa pripravuje 0,5 M roztok TCEP-HCl a ten sa upravuje na pH blízko neutrálnemu pH, ktorý sa potom skladuje pri -20 °C. TCEP je menej stabilný než fosfátové pufry.
História Redukcii biomolekúl pomocou trialkylfosfánov dlho nebola venovaná pozornosť, pretože historicky dostupné fosfány mali veľmi nepríjemný zápach a/alebo neboli rozpustné vo vode. V roku 1969 bol opísaný TCEP ako vo vode rozpustný trialkylfosfán bez zápachu pre biochemické použitie, ale jeho potenciál bol ignorovaný po dobu niekoľkých dekád. V roku 1991 opísal Burns novú syntetickú cestu, ktorou ho možno pripraviť, čo umožnilo bežnejšie použitie. Rovnako bol označený za „nové redukčné činidlo“ a začal sa bežne používať v 90. rokoch 20. storočia.
Referencie
Pozri aj 2-merkaptoetanol (BME) Ditiotreitol (DTT) Ditiobutylamín (DTBA)
Zdroj
Kategória:Trikarboxylové kyseliny Kategória:Fosfány Kategória:Redukčné činidlá