Po rozpadzie koalicji i upadku rządu we wrześniu 2005 po początkowych wahaniach regionaliści poparli kandydaturę Jurija Jechanurowa na nowego premiera, nie wchodząc jednocześnie do rządu.
W kampanii przed wyborami w 2006 PR stała się główną siłą opozycyjną wobec „pomarańczowych”. Jej działacze zarzucali władzy stosowanie szykan w związku z aresztowaniem Borysa Kołesnikowa, lidera w Doniecku. Kryzys energetyczny wywołany zimą 2006 przez odłączenie gazociągów przez Rosję przyczynił się do wzrostu popularności Partii Regionów postrzeganej jako prokremlowska. Na jej korzyść zadziałał również spór między liderami pomarańczowej rewolucji. W efekcie Partia Regionów 26 marca 2006 zwyciężyła w wyborach do parlamentu, otrzymując 33,12% głosów i 186 mandatów.
4 sierpnia tego samego roku powstał drugi rząd Wiktora Janukowycza oparty na Partii Regionów, popierany przez socjalistów, komunistów i Naszą Ukrainę, która opuściła koalicję po paru miesiącach.