Budowę istniejącego obecnie gotyckiego kościoła, już w innym miejscu, rozpoczęto po 1348, wznosząc w pierwszej fazie czteroprzęsłowe prezbiterium, a następnie sześcioprzęsłowy, trzynawowy, halowy korpus zachodni, którego przypory zostały wciągnięte do środka. Równocześnie trwała rozbudowa klasztoru. Budowę zakończono w 1487 wraz z wykonaniem sklepienia gwiaździstego. Podwyższono też wieżę o część ośmioboczną.
W okresie reformacji kościół kilkakrotnie był niszczony i plądrowany – w 1525 i 1576. Zakonnicy zostali wypędzeni z klasztoru, kilku z nich straciło życie.
W 1564 władze gdańskie oddały klasztor protestantom, a skarbiec klasztorny zabrano na ratusz. Po interwencji króla Zygmunta Augusta, klasztor w 1567 zwrócono dominikanom.
11 października 1587 w kościele św. Mikołaja miało miejsce wręczenie przybyłemu ze Szwecji królowi Zygmuntowi III aktu elekcji, po uprzednim (7 października) zaprzysiężeniu przez niego w kościele w Oliwie zobowiązań wobec Rzeczypospolitej, tzw. pacta conventa, uchwalonych przez Sejm.
Od tego momentu ponownie rozpoczął się okres świetności kościoła św. Mikołaja. W murach klasztoru zaczęło mieszkać coraz więcej zakonników, kwitło życie intelektualne i kaznodziejstwo, a kościół otrzymał nowe wyposażenie (główny ołtarz, stalle, ambonę, organy).