Dnia 4 grudnia tego samego roku uczestniczył w akcie złożenia przez Rady Panów Wielkiego Księstwa Litewskiego przysięgi wierność Zygmuntowi II Augustowi, uznając go w ten sposób nowym Wielkim Księciem Litewskim, w przypadku śmierci ojca, Zygmunta I Starego.
Jednakże już w 1523 roku, Radziwiłł związał się opozycją, związaną pod przewodnictwem hetmana wielkiego litewskiego, Konstantego Ostrogskiego. Relację z Ostrogskim umocnić miała zawarta w tym samym roku umowa o małżeństwo jego syna Ilii Ostrogskiego z najstarszą córką Jerzego, Anną I Radziwiłł.
Nie jest do końca jasne, z jakiego powodu Jerzy I Radziwiłł stanął przeciw przywódcy separatystów, Olbrachtowi Gasztołdowi, ponieważ konflikt polityczny zbiegł się w czasie z podjętymi przez Gasztołda pretensjami majątkowymi wobec wdowy po Mikołaju II Radziwille i ich synów. 30 czerwca 1528 r. doszło do ugody między Radziwiłłami a Gasztołdem.