Obsada Tobey Maguire jako Peter Parker / Spider-Man, uzdolniony nastolatek, który zostaje ugryziony przez genetycznie zmodyfikowanego pająka i zyskuje nadludzkie, pajęcze zdolności. Willem Dafoe jako Norman Osborn / Zielony Goblin, szef Oscorp, który testuje na sobie niestabilny wzmacniacz siły i staje się szalonym i potężnym Zielonym Goblinem. Nieświadomy prawdziwej tożsamości Spider-Mana, wchodzi w rolę ojca Parkera, zaniedbując własnego syna, Harry’ego. Kirsten Dunst jako Mary Jane Watson, dziewczyna, w której Parker podkochuje się od dzieciństwa, która jest aspirującą aktorką, a pracuje jako kelnerka. Ukrywa ten fakt przed swoim chłopakiem Harrym. James Franco jako Harry Osborn, najlepszy przyjaciel i współlokator Parkera, który spotyka się z Watson. Jest synem Normana Osborna. Cliff Robertson jako Ben Parker, mąż May i wujek Parkera, który zostaje zamordowany przez złodzieja samochodów. Rosemary Harris jako May Parker, wdowa po Benie i ciotka Parkera.
W filmie ponadto wystąpili: J.K. Simmons jako J.