Filip planował ponowne małżeństwo, ponieważ nadal nie miał męskiego potomka.
Bliskie pokrewieństwo pary skłoniło papieża Piusa V do wyrażenia zastrzeżeń co do tego związku, ale ostatecznie udzielił niezbędnej dyspensy. W lutym 1569 roku ogłoszono zaręczyny Anny z jej wujem Filipem II. Kontrakt małżeński między Filipem II a jego siostrzenicą, arcyksiężniczką Anną, został podpisany w Madrycie 24 stycznia 1570 roku. Ślub, celebrowany przez pełnomocnika, odbył się na Zamku Praskim 4 maja 1570 roku. Anna udała się z Austrii do Hiszpanii jesienią 1570 roku w towarzystwie braci Albrechta i Wacława.
Anna przepłynęła kanał La Manche, gdzie Elżbieta I Tudor wysłała swoich admirałów, Charles Howard (1. hrabia Nottingham) i Williama Wyntera, aby zaoferowali jej wsparcie i bezpieczną podróż. Podróżowali przez Niderlandy, gdzie do Anny podeszli przyjaciele i krewni Florisa de Montmorency, młodszego brata straconego Filipa van Montmorency, hrabiego Horn. Floris był więziony w Hiszpanii od 1567 roku. Teraz, gdy król Filip ponownie się ożenił, rodzina i przyjaciele Florisa mieli nadzieję na łaskę. Otrzymali obietnicę od przyszłej królowej, że zrobi wszystko, co możliwe, aby uwolnić Florisa. Jednak jej się to nie udało, ponieważ Floris został uduszony na rozkaz króla.