Po śmierci Fryderyka II wskutek tzw. podziału lipskiego (niem. Leipziger Teilung) z 1485 Saksonia ponownie została podzielona między synów władcy. Ernest, starszy syn, otrzymał północną Miśnię, południową Turyngię oraz Wittenbergę. Albrecht, młodszy, otrzymał północną Turyngię i południową Miśnię. Dodatkowo Ernest odziedziczył tytuł elektora. W 1486 do władzy doszedł Fryderyk III Mądry. Dla Wittenbergi nastał okres rozkwitu. W 1487 wybudowano nowy most na Łabie, a w 1490 rozpoczęto budowę nowej rezydencji książęcej, kościoła Wszystkich Świętych (Allerheiligen) oraz umocnień obronnych.
Reformacja Na początku XVI wieku Wittenberga liczyła ok. 2000 mieszkańców. W 1502 Fryderyk III założył w mieście uniwersytet, który przyczynił się do duchowego i gospodarczego rozkwitu miasta, przyciągając duchownych, uczonych i artystów. W 1503 wzniesiono pierwszy budynek uczelni, nazwany na cześć fundatora Fridericianum. W 1504 wybudowano tzw. Czarny Klasztor (niem. Schwarzer Kloster), siedzibę eremitów zakonu augustianów. mały|upright|Portret Marcina Lutra autorstwa Lucasa Cranacha Starszego W 1508 do miasta przybył z zamiarem kontynuacji studiów teologicznych mnich augustiański, Marcin Luter, późniejszy inicjator i teoretyk reformacji.