Powróciwszy do zdrowia wziął udział w ostatnich zmaganiach wojny krymskiej, by w grudniu 1856 roku wrócić wraz z Burtonem do Afryki. Celem ekspedycji, która wyruszyła z Bagamoyo koło Zanzibaru było poszukiwanie, na zlecenie Królewskiego Towarzystwa Geograficznego w Londynie, źródeł Nilu. W lutym obaj podróżnicy dotarli do Ujiji na brzegach jeziora Tanganika. Wobec choroby Burtona Speke samotnie eksplorował jezioro szukając ujścia, które mogłoby być wodami Nilu. Badania wykazały jednak, że wody jeziora są tylko o 3 metry wyżej niż Nil w Gondokoro w Sudanie.
Wiosną 1858 roku rozpoczęli podróż powrotną, jednakże w miejscowości Tabora, w połowie drogi do Oceanu, usłyszeli o wielkim jeziorze położonym za jeziorem Tanganika. Chory Burton został na miejscu, a Speke jako pierwszy Europejczyk dotarł do Jeziora Wiktorii, które uznał za źródło Nilu, choć wcześniej utracił ostatnie instrumenty pomiarowe.