Wskazania do stosowania thumb|Maści zawierające polimyksynę B: Tribiotic i Multibiotic Polimyksyna B stosowana jest doustnie w zakażeniach przewodu pokarmowego wywołanych na oporne na inne antybiotyki szczepy Escherichia coli oraz pałeczki Salmonella i Shigella. Pozajelitowo są stosowane w ciężkich zakażeniach układu moczowego wywołanych przez bakterie Gram (–), zwłaszcza Pseudomonas aeruginosa, oporne na inne antybiotyki (aminoglikozydowe, β–laktamowe). Jest też stosowana miejscowo na skórę, do oczu i uszu w zakażeniach bakteryjnych wywołanych przez szczepy wrażliwe na ten antybiotyk. Substancja ta rzadko jest podawana domięśniowo, ponieważ wstrzyknięcia są bardzo bolesne.
Przeciwwskazania niewydolność nerek nawet niewielkiego stopnia (przy podaniu dożylnym); nadwrażliwość na polimyskyny B; choroby wirusowe. Przy stosowaniu w okulistyce dodatkowo: grzybicze zapalenie spojówek; jaskra pierwotna; gruźlica oka.