Małżeństwo rozwścieczyło także Elżbietę, która uważała, że Darnley jako poddany angielski powinien uzyskać jej zgodę na ślub. Elżbieta czuła się teraz podwójnie zagrożona, ponieważ małżeństwo to dawało dzieciom Marii silne prawa do sukcesji tronu – zarówno szkockiego, jak i angielskiego.
Na długo przed zajściem Marii w ciążę Darnley stał się arogancki, zaczął żądać tytułowania go królem i takichże uprawnień. Był także zazdrosny o prywatnego sekretarza żony, Davida Rizzio (oskarżono go, że był kochankiem Marii, co raczej było wymysłem i miało pomóc w pozbyciu się zaufanego doradcy królowej). W marcu 1566 wszedł w spisek z pokonanymi przez Marię w 1565 lordami protestanckimi. 9 marca grupa lordów w towarzystwie Darnleya dokonała okrutnej zbrodni, zabijając Rizzia na oczach królowej. To zabójstwo przyspieszyło tylko rozkład nieudanego małżeństwa. Darnley wkrótce zmienił front i zdradził protestantów, przechodząc z powrotem do frakcji katolickiej. Przy innej okazji usiłował zaatakować żonę i spowodować, by poroniła.