W tym czasie zawiązał się także spisek przeciwko Darnleyowi, który był już chory (prawdopodobnie na syfilis) i przebywał w Glasgow, z dala od swej królewskiej małżonki. Z początkiem lutego 1567 Darnley, nakłoniony przez Marię, przybył do Edynburga i został zakwaterowany w domu zwanym Kirk o'Field, gdzie odwiedzała go żona. Nocą z 9 na 10 lutego 1567 dom zniszczyła potężna eksplozja, a Darnley został znaleziony martwy w ogrodzie, przy czym wyglądało na to, że został uduszony. To wydarzenie, które wydawało się być dla Marii wybawieniem, okazało się zgubne dla jej reputacji. Dziś historycy spierają się, czy to Maria, czy szkoccy arystokraci zainicjowali spisek przeciwko Darnleyowi. James Hepburn, 4. hrabia Bothwell, który miał zostać jej trzecim mężem, był uważany za sprawcę tego zabójstwa. Został nawet postawiony przed sądem, lecz go uniewinniono. Maria próbowała w tym czasie odzyskać poparcie wśród lordów.
24 kwietnia, po ostatnim ujrzeniu swojego niespełna rocznego syna w Stirling, Maria została porwana przez Bothwella i jego ludzi, gdy wracała do Edynburga. Została zabrana do , gdzie prawdopodobnie została przez niego zgwałcona.