Naomi Hunter jest odpowiedzialna za porady lekarskie, a Nastasha Romanenko dostarcza informacji o znalezionych przedmiotach i broni. Pomocą służą też Master Miller, były instruktor musztry i trener szkoły przetrwania oraz Mei Ling, która wynalazła system radarowy używany podczas misji. Gracz może się też z nią połączyć, jeśli chce zapisać swój postęp w grze.
Głównym antagonistą gry jest Liquid Snake, lider organizacji terrorystycznej powstałej z Foxhound oraz genetyczny brat Solid Snake’a. W skład elitarnej jednostki sił specjalnych Foxhound wchodzą eksperci specjalizujący się w wykonywaniu unikalnych zadań. Są to Revolver Ocelot, rewolwerowiec używający Colt Single Action Army będący ekspertem od przesłuchań, Sniper Wolf – mistrzyni wśród snajperów, Vulcan Raven – szaman pochodzący z Alaski, uzbrojony w działko M61, Psycho Mantis – ekspert od psychokinezy umiejący czytać w ludzkich umysłach oraz Decoy Octopus – mistrz kamuflażu.
Innymi postaciami pojawiającymi się w grze są Meryl Silverburgh, siostrzenica pułkownika Campbella, będąca początkującym żołnierzem przebywającym na wyspie podczas wybuchu rebelii, Dr.