Obiekt powstał, według prawosławnej tradycji, na miejscu zagajnika, w którym mieściło się pogańskie miejsce kultu - święty gaj. Prawosławna hagiografia wskazuje również, iż w miejscu tym w 1347 zostali powieszeni na dębie męczennicy wileńscy - Antoni, Jan i Eustachy. Z 1391 pochodzi pierwsza wzmianka o istnieniu przy świątyni monasteru. Według innego źródła klasztor istniał już w latach 1347–1350, a zatem powstał natychmiast po budowie cerkwi Świętej Trójcy. Przełożeni klasztoru otrzymywali każdorazowo godność archimandryty. Początkowo monaster mieścił się w zespole niewielkich drewnianych domów otaczających cerkiew.
Do końca XVI w. monaster Trójcy Świętej był najbardziej szanowanym klasztorem prawosławnym na Litwie. Jego majątek powiększał się dzięki prywatnym nadaniom. W 1460 marszałek A. Sołtan przekazał monasterowi znaczne dary pieniężne i rzeczowe (księgi, wyposażenie cerkiewne). W 1506 M. Gliński darował klasztorowi 10 kop groszy.