Do seminarium w Wilnie w okresie międzywojennym przyjmowani byli mężczyźni wyznania prawosławnego, obywatele polscy. To samo obywatelstwo było wymagane od kandydatów na wykładowców, których wskazywał Sobór Biskupów PAKP, zaś zatwierdzał minister wyznań religijnych i oświecenia publicznego. Naukę w szkole mogli podejmować absolwenci czteroklasowych szkół ogólnokształcących, równorzędnych szkół prywatnych. Dla osób nieposiadających takiego wykształcenia przeprowadzany był egzamin wstępny. Zakwaterowanie w internacie nie było obowiązkowe. W 1921 korzystało z niego 70 słuchaczy z ogółu 200. Od reformy w 1924 do 1932 w seminarium nauczane były przedmioty teologiczne oraz świeckie: język polski, geografię powszechną i Polski, wiedzę o Polsce, przyrodę z logiką, filozofię, fizykę, chemię, rysunek kaligraficzny, śpiew, matematykę, gimnastykę. Z języków obcych słuchacze obowiązkowo poznawali łacinę i grekę, język rosyjski oraz do wyboru język białoruski lub ukraiński.