Niezależność ta powodowała konflikty między ośrodkiem praskim, roszczącym sobie prawo do zwierzchnictwa, a wrocławskim.
Okres rozkwitu i kryzysu W 1252 św. Agnieszka położyła kamień węgielny pod nowy szpital i klasztor zakonu na staromiejskim brzegu Wełtawy przy Moście Judyty. Wybudowano wtedy kościół pw. św. Ducha wraz ze szpitalem pw. św. Franciszka oraz klasztor. Po śmierci swojego protektora Przemysława Ottokara II zakon przeżywał w Czechach kryzys, czemu zaradziła reforma przeprowadzona w 1292. W ramach tej reformy, na mocy dekretu papieskiego Decreta Reformationis per Visitatores Apostolicos, rozwiązana została żeńska część zakonu.
Do największego rozkwitu zgromadzenia doszło za panowania cesarza Karola IV. Prowincja czeska posiadała wówczas 60 szpitali, domów zakonnych i kościołów (w 1329 zakon sprawował pieczę nad 28 kościołami na ziemiach czeskich i na Węgrzech). Oprócz Czech i Węgier zakon posiadał duży klasztor we Wrocławiu, któremu podlegały placówki na Śląsku i Kujawach.