W 1542 papież Paweł III powołał do życia Kongregację Rzymskiej i Powszechnej Inkwizycji, która stała się naczelnym sądem inkwizycyjnym we Włoszech, koordynującym działania lokalnych inkwizytorów przeciwko przenikaniu herezji protestanckich do Włoch. Trybunał boloński był jednym z tych, które najwcześniej podjęły ścisłą współpracę z Kongregacją. Już w 1550 Kongregacja przejęła od władz zakonu dominikańskiego kontrolę nad nominacjami inkwizytorskimi w BoloniiBattistella, s. 199.. Procesy przeciwko domniemanym zwolennikom reformacji rozpoczęły się w Bolonii już w roku 1543. Najbardziej spektakularnym sukcesem bolońskiej inkwizycji w tym czasie było nawrócenie biskupa anabaptystów Pietro Manelfiego w 1551, który wyjawił bardzo dużo informacji na temat swych byłych współwyznawcówDel Col, s. 326-327.. Największe nasilenie represji antyprotestanckich miało jednak miejsce w latach 1566–1569, gdy wielu protestantów spalono, potępiono zaocznie, skazano na galery lub przekazano do Rzymu w celu osądzeniaDel Col, s. 434-436.. Sporadycznie dochodziło też do procesów o czaryDel Col, s. 592-593..
W latach 1568–1569 wybudowana została nowa siedziba trybunału inkwizycyjnegoTavuzzi, s. 31-32..