Poliklonska antitijela (pAbs) (pAbs) su antitijela koja se izlučuju iz različitih linija B-ćelija unutar tijela, dok monoklonska antitijela potiču iz jedne jedine ćelijske loze. Oni su skup imunoglobulinskih molekula koje reagiraju protiv određenog antigena, pri čemu svaki identificira različit epitop.
Proizvodnja Općii postupak za proizvodnju poliklonskih antitijela je slijedeći: Priprema antigena; Selekcija i priprema adjuvanata; Izbor životinja; Proces ubrizgavanja; Ekstrakcija krvnog seruma. Konjugat antigen/adjuvans ubrizgava se životinji po izboru kako bi se pokrenuo pojačani imunski odgovor. Nakon niza injekcija tokom određenog vremenskog perioda, očekuje se da će životinja stvoriti antitela protiv konjugata. Zatim se iz životinjama ekstrahira krv, a zatim se pročisti kako bi se dobilo antitijelo od interesa. Inokulacija se izvodi na prikladnom sisaru, kao što su miš, zec ili kozaj. Često su poželjni veći sisari jer je količina seruma koja se može prikupiti veća. U sisare se ubrizgava antigen. To inducira B-limfocite da proizvode IgG imunoglobulin specifičan za antigen. Ovaj poliklonski IgG pročišćen je iz seruma sisara.
Suprotno tome, monoklonska antitijela su izvedena iz jedne jedine ćelijske linije. Postoje mnoge metodologije za proizvodnju poliklonskih antitijela kod laboratorijskih životinja. Institucijske smjernice koje reguliraju upotrebu životinja i postupke koji se odnose na te metodologije općenito su orijentirane na humana razmatranja i primjereno ponašanje za upotrebu adjuvans (sredstva koja mijenjaju učinak drugih uzročnika, dok imaju malobrojne, ako bilo kakve izravne učinke, ako ih daju sami) . To uključuje izbor adjuvansa, rute i mjesta primjene, količinu ubrizgavanja po mjestu i broj mjesta na životinji. Institucijske politike obično uključuju dozvoljene količine krvi po uzimanju i mjere opreza, uključujući odgovarajuće zadržavanje i sedaciju ili anesteziju životinja radi sprečavanja ozljeda životinja ili osoblja.
Primarni cilj proizvodnje antitijela kod laboratorijskih životinja je postizanje visokog titra, visokog afiniteta antiseruma za upotrebu u eksperimentima ili dijagnostičkim testovima. Adjuvansi koriste se za popravak ili poboljšanje imunskog odgovora na antigene. Većina adjuvanasa predviđa mjesto ubrizgavanja, depo antigena koji omogućava sporo oslobađanje antigena u drenažne limfne čvorove.
Mnogi adjuvansi također sadrže ili djeluju direktno kao: površinski aktivnia tvari koje promoviraju koncentraciju proteinskih molekula na velikoj površini i imunostimulirajuće molekule ili svojstva. Adjuvansi se obično koriste sa topivim proteinskim antigenima za povećanje titra antitijela i induciranje produženog odgovora sa pratećom memorijom. Takvi antigeni sami po sebi su uglavnom loši imunogeni. Većina složenih proteinskih antigena inducira više B-ćelijskih klonova za vrijeme imunološkog odgovora, pa stoga je reakcija poliklonska. Imunski odgovori na neproteinske antigene uglavnom su slabi ili pojačani pomoću adjuvansa i nemaju sistemske memorije.
Antitijela se također proizvode od izolata humanih B-limfocita za proizvodnju specifičnih rekombinantnih smješa monoklonskih antitela. Biotehnološka kompanija, Symphogen, razvija ovaj tip antitijela za terapijsku upotrebu. Oni su prva istraživačka kompanija koja je dostigla dvije faze ispitivanja sa monoklonskim mješavinama antitela koja oponašaju raznolikost antitela, kao poliklonskih lijekova. Ova proizvodnja sprječava prijenos virusa i priona i to je jednostavan postupak.
Izbor životinja Životinje koje se često koriste za proizvodnju poliklonskih antitijela uključuju piliće, koze, zamorce, hrčke, konje, miševe, pacove i ovce. Međutim, kunić je u te svrhe najčešće korištena laboratorijska životinja. Izbor životinja treba temeljiti na: potrebnoj količini antitiiela, odnosu između davatelja antigena i primatelja proizvedenih antitijela (općenito, što su filogenetski udaljeniji, veći je potencijal za odgovor na antitijelo visokog titra) i potrebnim svojstvima (npr. klasa, podrazred (izotip), komplement koji fiksira prirodu antitijela koja treba napraviti. Imunizacija i flebotomija povezani su sa stresom i, barem kada se koriste zečevi i glodari, preferiraju se životinje bez specifičnih patogena (SPF). Upotreba takvih životinja može dramatično smanjiti morbiditet i smrtnost zbog patogenih organizama, posebno ‘’Pasteurella multocida“ kod kunića.
Koze ili konji se obično koriste kada su potrebne velike količine antiseruma. Mnogi istraživači favoriziraju piliće, zbog filogenetske udaljenosti od sisara. Pilići donose velike količine IgY (IgG) u žumancetu, a skupljanje antitijela iz jaja eliminira potrebu za invazivnim postupkom krvarenja. Jaja u jednoj sedmici mogu sadržavati 10 puta više antitijela od volumena krvi kunića dobijenog jednosedmičnim krvarenjem. Međutim, postoje i neki nedostaci kada se primjenjuju određena antitijela koja se dobijaju od pilića u imunološkim testovima. Pileći IgY ne fiksira komponentu komplementa sisara i ne djeluje kao taložno antitijelo koristeći standardne otopine. Iako se miševi najčešće koriste za proizvodnju monoklonskih antitijela, njihova mala veličina obično sprečava njihovu upotrebu za dovoljne količine poliklonalnih antitijela u serumu. Međutim, poliklonska antitijela kod miševa mogu se prikupiti iz peritoneumske tekućine koristeći bilo koji od niza metodologija za njenu proizvodnju.
Kada koristite zečeve, mlade odrasle životinje (od 2,5-3,0 kg) treba koristiti za primarnu imunizaciju zbog snažnog odgovora antitela. Vrhovi imunske funkcije u pubertetu i primarni odgovori na nove antigene opadaju s godinama. Ženke zečeva općenito preferiraju jer su poslušnije i smatra se da posjeduju snažniji imunski odgovor od mužjaka. Najmanje dvije životinje po antigenu trebaju se upotrijebiti kada se koriste uginule životinje. Ovaj princip smanjuje potencijalni potpuni neuspjeh koji je posljedica neodgovaranja na antigene pojedinih životinja.
Priprema antigena Veličina, opseg agregacije i relativna aktivnost proteinskih antigena mogu dramatično uticati na kvalitet i količinu proizvedenih antitela. Mali polipeptidi (<10 ku) i neproteinski antigeni općenito trebaju biti konjugirani ili umreženi u veće, imunogene, proteinske nosače da bi povećali imunogenost i osigurali ćelijski epitop. Općenito, što je veći imunogeni protein to je bolje. Veći proteini, čak i u manjim količinama, obično rezultiraju boljim angažmanom antigena koje predstavljaju ćelije za obradu antigena za zadovoljavajući imunski odgovor. Injekcija rastvorljivih, neagregiranih proteina ima veću vjerovatnost za indukciju tolerancije nego zadovoljavajući odgovor antitijela.
Hemocijaninske ključanice (KLH) i albumin iz goveđeg seruma dva su široko korištena proteinska nosača. Poli-L-lizin se takođe uspešno koristi kao okosnica za peptide. Iako upotreba poli-L-lizina smanjuje ili eliminira proizvodnju antitijela na strane proteine, to može rezultirati neuspjehom proizvodnje antitijela izazvanih peptidom. U posljednje vrijeme liposomi se također uspješno koriste za isporuku malih peptida i ova je tehnika alternativa isporuci uljnim adjuvansima emulzije.
Ključni prsten hemocijanina (KLH) albumina iz goveđeg seruma dva su široko korištena proteinska nosača. Poli-L-lizin se također uspješno koristi kao okosnica za peptide. Iako upotreba poli-L-lizina smanjuje ili eliminira proizvodnju antitijela na strane proteine, to može rezultirati neuspjehom proizvodnje antitijela izazvanih peptidom. U posljednje vrijeme liposomi se također uspješno koriste za isporuku malih peptida i ova je tehnika alternativa isporuci uljnim dodacima emulzije.
Količina antigena Izbor količine antigena za imunizaciju varira ovisno o svojstvima antigena i odabranom adjuvansu. Općenito, količine mikrograma do miligrama proteina u adjuvansu su potrebne da bi se dobilo antitijelo visokog titra. Doziranje antigena uglavnom je povezano s vrstama, a ne tjelesnom težinom. Takozvani "prozor" imunogenosti kod svake vrste je širok, ali previše ili premalo antigena može izazvati toleranciju, supresiju ili imunsku devijaciju prema ćelijskoj imunosti, a ne zadovoljavajući humoralni odgovor. Optimalne i uobičajene razine antigena proteina za imuniziranje specifičnih vrsta zabilježene su u sljedećim rasponima: zec, 50-1000 µg; miš, 10–50 µg; zamorac, 50–500 µg; i koza, 250–5000 µg. Izvještava se da su optimalne „početne“ doze na kraju svakog raspona. Afinitet serumskih antitijela povećava se s vremenom (mjesecima) nakon ubrizgavanja mješavine antigenskih adjuvansa i kako se antigen u sistemu smanjuje. Široko korištene doze antigena za "pojačivače" ili sekundarne imunizacije obično su jedna polovina jednaka početnim dozama. Antigeni ne bi trebali sadržavati preparativne nusprodukte i kemikalije poput poliakrilamidnog gela, SDS-a, ureje, endotoksina, čestica i ekstremnih vrijednosti pH.
Peptidna antitijela Kada se peptid koristi za stvaranje antitijela, vrlo je važno pravilno dizajnirati antigene. Postoji nekoliko resursa koji mogu pomoći u dizajnu, kao i tvrtke koje nude ovu uslugu. Expasy je skupio skup javnih alata na sajtu ProtScale stranici za navigaciju za koju je potreban određeni stupanj korisničkog znanja. Za jednostavniji alat za ocjenjivanje peptida dostupan je alat Antigen Profiler koji će vam omogućiti ocjenu pojedinačnih sekvenci peptida na temelju relativne baze podataka mapiranja epitopa iz prethodnih imunogena koji se koriste za stvaranje antitijela. Konačno, u pravilu peptidi trebaju slijediti neke osnovne kriterije. Prilikom ispitivanja peptida na sintezu i imunizaciju, preporučuje se izbjegavanje određenih ostataka i sekvenci zbog potencijalnih problema sinteze. To uključuje neke od češćih karakteristika: Ekstremno duga ponavljanja iste aminokiseline (npr. RRRR) Dupliđe serije serina (S), treonina (T), alanina (A) i valina (V) Završavanje ili započinjanje niza s prolinom (P) Glutamin (Q) ili asparagin (N) na n-kraju Peptidi prekomjerni s hidrofobnim ostacima (npr. V, A, L, I, itd.)
Reaktivnost Istražitelji bi tako trebali razmotriti status nativnosti proteinskih antigena kada se koriste kao imunogeni i reagiraju s proizvedenim antitijelima. Antitijela na nativne proteine najbolje reagiraju s nativnim proteinima, a antitijela na denaturirane proteine najbolje reagiraju s denaturiranim proteinima. Ako će izazvana antitijela biti korištena na membranskim bojama (proteini podvrgnuti denaturirajućim uvjetima), tada bi se antitijela trebala napraviti protiv denaturiranih proteina. S druge strane, ako će se antitijela upotrebiti za reakciju s nativnim proteinima ili blokirati aktivno mjesto proteina, tada bi antitijela trebalo da se stvaraju protiv nativnog proteina. Adjuvansi često mogu mijenjati nativnost proteina. Općenito, apsorbirani proteinski antigeni u prethodno formiranom adjuvansu emulzije ulje u vodi zadržavaju veću prirodnu strukturu proteina od one u emulzijama voda u ulju.
Aseptičnost Antigene uvijek treba pripremati primjenom tehnika kojima se osigurava da nisu kontaminirani mikrobima. Većina proteinskih preparata može se sterilizirati prolaskom kroz 0,22 μm filter. Septički apscesi često se javljaju na mjestima inokulacije životinja kada se koriste kontaminirani pripravci. Ovo može rezultirati neuspjehom imunizacije protiv ciljanog antigena.
Adjuvansi