náhled|Rozdělené složky černého inkoustu pomocí TLC Chromatografie na tenké vrstvě (zkratka TLC z anglického Thin Layer Chromatography) je jednou z metod chromatografie, která nachází uplatnění při kvalitativní i kvantitativní analýze především organických látek. Kapalná mobilní fáze obsahující analyty při ní vzlíná skrz tenkou vrstvu pevné stacionární fáze a analyty jsou přitom děleny podle rozdílné afinity ke stacionární fázi, například vlivem přítomnosti určitých funkčních skupin.
Metodu vyvinul v roce 1906 ruský botanik Michail Cvět.
Princip metody
Stacionární fáze náhled|Destičky se stacionární fází používané při TLC. náhled|Modifikované molekuly silikagelu ve stacionární fázi. Stacionární fázi tvoří přibližně 100-250 μm tenká vrstva adsorpčního materiálu nanesená rovnoměrně na skleněnou, plastovou nebo hliníkovou destičku. Nejčastěji se jako stacionární fáze používá silikagel, často také alumina nebo celulóza. Molekuly stacionární fáze mohou být dále upraveny, například hydroxylové skupiny silikagelu mohou být nahrazeny jinými chemickými skupinami pro získání specifických vlastností.
Destičky jsou komerčně dostupné už s nanesenou stacionární fází o dané tloušťce, hrubosti a složení, a je nutné je pečlivě skladovat, aby nedošlo k jejich poškození poškrábáním, teplem nebo slunečním zářením, nebo znehodnocení vzdušnou vlhkostí.
Mobilní fáze Mobilní fáze (též vyvíjecí soustava) je zpravidla směs organických rozpouštědel, která vzlíná po vrstvě stacionární fáze a unáší s sebou určované analyty. Podle povahy testovaných látek se používají různé směsi rozpouštědel nebo méně častěji čistá rozpouštědla. Žádoucí je, aby se látka v rozpouštědle nerozpouštěla dokonale, jinak by snadno vyvzlínala zároveň s mobilní fází až k čelu a Rf by bylo rovno téměř 1. Proto se také volí takové soustavy rozpouštědel, kdy se v jednom z nich látka rozpouští snadno a v druhém téměř ne.
Běžné používané soustavy jsou například:
čistý ethanol chloroform:ethanol 9:1 chloroform:ethanol 19:1 hexan:ethylacetát 7:3 chloroform:aceton 85:15
V praxi je vhodné použít několik podobných soustav a zjistit v nich retenční faktory pro konkrétní látku, čímž se zvýší přesnost TLC analýzy.
Postup žádné|náhled|500x500pixelů|Schéma chromatografie na tenké vrstvě (1 - startovní linie; 2,3 - analyty; 4 - čelo mobilní fáze) Testovaná látka se nanese na jedno (např. tužkou označené) místo destičky nakapáním, mnohem častěji však „naočkováním“ tenkou kapilárou s roztokem vzorku. Toto místo se nazývá startovní skvrna nebo prostě start. Podle potřeby lze také při zachování přímky nanést několik vzorků nebo vzorek (vzorky) a skupinu standardních roztoků známých sloučenin. Jednotlivé látky musí být naneseny dostatečně daleko od okrajů destičky (asi 0,8-1 cm od spodní hrany) a také od sebe navzájem.
Poté se destička vysuší a vloží se do vyvíjecí komory, na jejímž dně je mělká vrstva (asi 0,5 cm) mobilní fáze, která okamžitě začne vzlínat vzhůru skrz stacionární fázi. Při svém postupu narazí na analyzované látky a začne je unášet různou rychlostí podle afinity analytů ke stacionární fázi. Uplatňuje se zde většinou pravidlo, podle kterého látky, které jsou vlastnostmi (například polaritou) podobnější mobilní fázi, jsou unášeny rychleji a doputují dále od startovní linie. Chromatografie je ukončena, když čelo mobilní fáze dovzlíná maximálně 1 cm od horního okraje destičky, a destička je následně důkladně vysušena, aby byly odstraněny zbytky rozpouštědel.
V některých speciálních aplikacích se používá tzv. 2D TLC, kdy se destička vyvíjí standardně v jedné soustavě, poté se otočí o 90° a vyvíjí se v jiné vhodné soustavě.
Stanovení výsledku
Samotné rozdělení by ani nebylo tolik zajímavé, kdyby se tak látky nedělily vždy stejně. V laboratoři tedy stačí mít připravené standardy a sledovat, jestli se chovají stejně jako analyzovaný vzorek. Každé chemické individuum se chová odlišně podle použité vyvíjecí soustavy (směs rozpouštědel použitá k vyvíjení chromatogramu). V různých soustavách tak můžeme pozorovat skvrnu (popř. skvrny) jedné látky v různé vzdálenosti od startu k čelu (místo kam až dovzlínala mobilní fáze). Tuto skutečnost vyjadřuje bezrozměrná veličina nazývaná retenční (retardační) faktor Rf. Ten lze vypočítat:
Kdy VM vzdálenost středu skvrny od startu a VR vzdálenost čela od startu. Retenční faktor závisí na konkrétní vyvíjecí soustavě, na povaze látky, ale i na dalších faktorech (např. na teplotě, množství nanesené látky). Dodržíme-li však laboratorní teplotu, lze Rf používat jako jednu z orientačních hodnot pro zkoušenou látku (vždy se musí uvádět s použitou soustavou). Přesto se téměř vždy používá určitý standard např. pro porovnání Rf. náhled|Destička po skončení TLC pod UV lampou Ne všechny látky jsou však barevné a tedy ne vždy provádíme přímé hodnocení chromatogramu. Ke zviditelnění skvrn můžeme použít chemické činidlo a chromatogram tzv. „vyvolat“. (např. nástřik ninhydrinem pro zviditelnění aminokyselin, vložení do par jódu apod., viz Reakční činidla v TLC). Chromatogramy se také často pozorují pod UV zářením, které řada látek specificky pohlcuje a proto jsou bezbarvé skvrny mnoha látek na TLC pod UV světlem barevné. Tuto vlastnost mají např. všechny aromatické organické sloučeniny (absorpci UV vykazuje benzenové jádro). Některé látky na TLC také světélkují (např. kyselina anthranilová a chinolindiony mají po ozáření UV výraznou fialovou fluorescenci, kyselina salicylová fluoreskuje modře). Tato vlastnost však závisí na vlnové délce UV lampy a povaze fluorescenčního indikátoru dané TLC desky (uvedené údaje jsou vztaženy k vlnové délce 254 nm (tj. standardní vlnová délka laboratorních UV lamp).
Pokud jsou vzorky značeny radionuklidem, lze je detekovat měřením radiace.
Využití TLC
Chromatografie na tenké vrstvě nalézá široké uplatnění v řadě laboratorních metod a v mnoha odvětvích chemie. V analytické chemii může pomoci na základě porovnání se standardem určit přítomnost konkrétní látky ve vzorku. Ačkoliv většina analytických stanovení je dnes založena na metodách instrumentální analýzy, existuje řada rychlých orientačních metod pro stanovení některých látek ve vzorku (např. stanovení PCB). V organické chemii je hojně používaná ke sledování průběhu reakce (pravidelným odebíráním reakční směsi a „očkováním“ na TLC vedle standardu eduktu či produktu lze nejen odhadovat, co se v reakční směsi děje, ale zejména zjistit zda je stále přítomný edukt – výchozí látka). Neméně významné je také uplatnění TLC při určování vhodnosti elučních systémů pro sloupcovou chromatografii a pro detekci látek v jednotlivých frakcích sloupcové chromatografie.
Preparativní TLC náhled|Výsledek preparativní TLC Chromatografie na tenké vrstvě může být vzácněji využita pro separaci produktu reakce z roztoku. Na destičku je v tomto případě rovnoměrně nanesen delší horizontální pás roztoku. Po skončení chromatografie je seškrábnuta část stacionární fáze s požadovanou látkou, stacionární fáze je extrahována vhodným rozpouštědlem a filtrací lze získat čistou požadovanou látku. Tuto techniku je nejvhodnější použít v případech, kdy jsou rozdělené látky viditelné pouhým okem nebo identifikovatelné při UV záření, a kdy se látky v roztoku snadno a spolehlivě rozdělí.
Stejným postupem lze TLC využít jako kvantitativní analýzu: koncentrace látky v roztoku po extrakci stacionární fáze se určí například spektrofotometricky, porovnáním se standardy o známé koncentraci.
Odkazy
Reference
Literatura Petr Galuszka a Lenka Luhová : Laboratorní technika pro biochemiky (UP Olomouc 2005) Andrlík, Šimek: Základy laboratorní práce (1953) John McMurry: Organická chemie (VUTIUM 2007 – první vydání)
Externí odkazy
Seriál o detektivní chemii v brožuře KSICHTu
Kategorie:Metody kvalitativní analýzy Kategorie:Forenzní chemie na tenké vrstvě Kategorie:Metody kvantitativní analýzy