Рибулоза-1,5-бисфосфат карбоксилаза/оксигеназа, попозната под кратенката RuBisCo е ензим (EC 4.1.1.39) вклучен во светло-независниот (или „темниот“) дел од фотосинтезата, вклучувајќи ја и фиксацијата на јаглерод со која атмосферскиот јаглерод диоксид се претвора од растенијата и другите фотосинтетски организми во молекули богати со енергија како што е гликозата. Се појавила пред приближно четири милијарди години во исконскиот метаболизам пред присуството на кислород на Земјата.Back to the future of photosynthesis: Resurrecting billon-year-old enzymes reveals how photosynthesis adapted to the rise of oxygen., News from the Max Planck Society, October 13, 2022 Веројатно е најзастапениот ензим на Земјата. Во хемиска смисла, катализира карбоксилација на рибулоза-1,5-бисфосфат (исто така познат како RuBP).
Алтернативни патишта за фиксација на јаглерод RuBisCO е биолошки важна бидејќи катализира примарната хемиска реакција преку која неорганскиот јаглерод влегува во биосферата. Додека многу автотрофни бактерии и археи го фиксираат јаглеродот преку редуктивниот ацетил CoA пат, 3-хидроксипропионатниот циклус или обратниот Кребсов циклус, овие патишта се релативно мали придонесувачи за глобалната фиксација на јаглерод во споредба со онаа катализирана од RuBisCO. Фосфоенолпируват карбоксилазата, за разлика од RuBisCO, само привремено го фиксира јаглеродот. Одразувајќи ја својата важност, RuBisCO е најзастапениот протеин во лисјата, сочинувајќи 50% од растворливиот протеин на листот кај C3 растенијата (20-30% од вкупниот азот на листот) и 30% од растворливиот протеин на листот кај C4 растенијата (5-9% од вкупниот азот на листот). Со оглед на неговата важна улога во биосферата, генетскиот инженеринг на RuBisCO кај културите е од континуиран интерес.
Структура мини|Активно место на RuBisCO на Galdieria sulphuraria со CO : Остатоците вклучени и во активното место и стабилизирачкиот CO за ензимска катализа се прикажани во боја и означени. Растојанијата интеракциите на водородните врски се прикажани во ангстреми. јон (зелена сфера) е прикажан координиран CO, а по него следат три молекули на вода (црвени сфери). Сите други остатоци се поставени во сива скала. мини|Локација на генот rbcL во хлоропластниот геном на Arabidopsis thaliana (позиции околу 55-56,4 kb). rbcL е еден од 21-те гени што кодираат протеини вклучени во фотосинтезата (зелени кутии). Кај растенијата, алгите, цијанобактериите и фототрофните и хемоавтотрофните Pseudomonadota (порано познати како протеобактерии), ензимот обично се состои од два вида протеински подединици, наречени голем ланец (L, околу 55.000 Da) и мал ланец (S, околу 13.000 Da). Генот за голем ланец (rbcL) е кодиран од ДНК-та на хлоропластот кај растенијата. Во јадрото на растителните клетки обично има неколку поврзани гени за мал ланец, а малите ланци се внесуваат во стромалниот оддел на хлоропластите од цитозолот со преминување на надворешната хлоропластна мембрана.Arabidopsis thaliana has four RuBisCO small chain genes. Ензимски активните места за врзување на супстратот (рибулоза 1,5-бисфосфа) се наоѓаат во големите ланци кои формираат димери во кои аминокиселините од секој голем ланец придонесуваат за местата за врзување. Вкупно осум големи ланци (= четири димери) и осум мали ланци се составуваат во поголем комплекс од околу 540.000 Da. Кај некои Pseudomonadota и динофлагелати, пронајдени се ензими кои се состојат само од големи подединици.
Магнезиумови јони () се потребни за ензимска активност. Правилно позиционирање на () во активното место на ензимот вклучува додавање на „активирачки“ молекул на јаглерод диоксид врз лизин во активното место (формирајќи карбамат). Figure 16-48 shows a structural model of the active site, including the involvement of magnesium. Mg2 + функционира така што предизвикува депротонација на остатокот Lys210, предизвикувајќи остатокот Lys да ротира за 120 степени кон транс конформерот, намалувајќи го растојанието помеѓу азотот на Lys и јаглеродот на CO. Близината овозможува формирање на ковалентна врска, што резултира со карбамат. Mg2 + прво се овозможува да се врзе за активното место со ротација на His335 во алтернативна конформација. Mg2 + потоа е координиран од His остатоците од активното место (His300, His302, His335) и делумно е неутрализиран со координацијата на три молекули на вода и нивната конверзија во −OH. Оваа координација резултира со нестабилен комплекс, но создава поволна средина за врзување на . Формирањето на карбамат е фаворизирано од алкална pH вредност. pH вредноста и концентрацијата на магнезиумови јони во течниот дел (кај растенијата, стромата на хлоропластот) се зголемуваат на светлина. Откако ќе се формира карбаматот, His335 ја финализира активацијата со враќање во својата почетна положба преку термичка флуктуација.
Ензимска активност центар|мини|Две главни реакции на RuBisCo: фиксација на јаглерод диоксид и оксигенација. RuBisCO е еден од многуте ензими во калвиновиот циклус. Кога Rubisco го олеснува нападот на CO на C2 јаглеродот на RuBP и последователното раскинување на врската помеѓу C3 и C2 јаглеродот, се формираат 2 молекули на глицерат-3-фосфат. Конверзијата ги вклучува овие чекори: енолизација, карбоксилација, хидратација, раскинување на CC врската и протонација.
Супстрати Супстратите за RuBisCO се рибулоза-1,5-бисфосфат и јаглерод диоксид. RuBisCO исто така катализира реакција на рибулоза-1,5-бисфосфат и кислород (O2) наместо јаглерод диоксид (). Разликувањето помеѓу супстратите and O2 се припишува на различните интеракции на квадрополните моменти на супстратот и високиот градиент на електростатското поле. Овој градиент се воспоставува со димерната форма на минимално активниот RuBisCO, кој со своите две компоненти обезбедува комбинација од спротивно наелектризирани домени потребни за интеракцијата на ензимот со и O2. Овие услови помагаат да се објасни ниската стапка на флуктуација пронајдена во RuBisCO: За да се зголеми јачината на електричното поле потребно за доволна интеракција со квадруполните моменти на супстратите, C- и N-терминалните сегменти на ензимот мора да се затворат, овозможувајќи активното место да се изолира од растворувачот и намалување на диелектричната константа. Оваа изолација има значителна ентропска цена и резултира со ниска стапка на флуктуација.
Врзување на RuBP Карбамилацијата на ε-амино групата на Lys210 е стабилизирана со координација со . Оваа реакција вклучува врзување на карбоксилатните групи на Asp203 и Glu204 за јон. Супстратот RuBP се врзува за и ги заменува два од трите акво лиганди.
Енолизација Енолизацијата на RuBP е конверзија на кето тавтомерот на RuBP во енедиол(ат). Енолизацијата се иницира со депротонација на C3. Ензимската база во овој чекор е предмет на дебата, но стеричните ограничувања забележани во кристалните структури го прават Lys210 најверојатен кандидат. Поточно, карбаматниот кислород на Lys210 кој не е координиран со Mg јонот го депротонира C3 јаглеродот на RuBP за да формира 2,3-енедиолат.
Карбоксилација мини|3Д слика од активното место на ензимот RuBisCO од спанаќ во комплекс со инхибиторот 2-карбоксиарабинитол-1,5-бисфосфат, , и . (PDB: 1IR1; Лигандски приказ [CAP]501:A) Карбоксилацијата на 2,3-енедиолатот резултира со интермедиер 3-кето-2-карбоксиарабинитол-1,5-бисфосфат а Lys334 е позициониран да го олесни додавањето на CO супстратот додека го заменува третиот -координиран молекул на вода и се додава директно на енедиолот. Во овој процес не се формира Михаелисов комплекс. Хидратацијата на овој кетон резултира со дополнителна хидрокси група на C3, формирајќи меѓупроизвод гем-диол. Карбоксилацијата и хидратацијата се предложени или како еден заеднички чекор или како два последователни чекори. Заедничкиот механизам е поткрепен од близината на молекулата на водата до C3 на RuBP во повеќе кристални структури. Во рамките на структурата на спанаќот, другите остатоци се добро поставени за да помогнат во чекорот на хидратација бидејќи се во рамките на растојанието на водородните врски од молекулата на водата.
Раскинување на C-C врска Интермедиерот гем-диол ја разложува врската C2-C3 за да формира еден молекул на глицерат-3-фосфат и негативно наелектризиран карбоксилат. Стерео-специфичната протонација на C2 од овој карбанjон резултира со друг молекул на глицерат-3-фосфат. Се смета дека овој чекор е олеснет од Lys175 или потенцијално карбамилираниот Lys210.
Производи Кога јаглерод диоксидот е супстрат, производот од карбоксилазната реакција е нестабилен шест-јаглеродно фосфорилиран меѓупроизвод познат како 3-кето-2-карбоксиарабинитол-1,5-бисфосфат, кој брзо се распаѓа во два молекули глицерат-3-фосфат. Овој производ, познат и како 3-фосфоглицерат, може да се користи за производство на поголеми молекули како што е гликоза.
Кога молекуларниот кислород е подлога, производите на оксигеназната реакција се фосфогликолат и 3-фосфоглицерат. Фосфогликолатот се рециклира преку низа реакции наречени фотореспирација, која вклучува ензими и цитохроми лоцирани во митохондриите и пероксизомите. Во овој процес, две молекули на фосфогликолат се претвораат во една молекула јаглерод диоксид и една молекула 3-фосфоглицерат, кои можат повторно да влезат во циклусот на Калвин. Дел од фосфогликолатот што влегува во овој пат може да биде задржан од растенијата за да произведат други молекули како што е глицинот. На амбиентални нивоа на јаглерод диоксид и кислород, односот на реакциите е околу 4 спрема 1, што резултира со нето фиксација на јаглерод диоксид од само 3,5. Така, неможноста на ензимот да ја спречи реакцијата со кислород значително го намалува фотосинтетскиот капацитет на многу растенија. Некои растенија, многу алги и фотосинтетски бактерии го надминале ова ограничување со презаобиколување на реакцијата за зголемување на концентрацијата на јаглерод диоксид околу ензимот, вклучувајќи фиксација C јаглерод, метаболизам на красулацеанска киселина и употреба на пиреноид.
RuBisCO доведува и до споредни продукти кој се непотребни или инхибиторни за растението, како што се ксилулоза 1,5-бифосфат и глицеро-2,3-пентодиулоза 1,5-бифосфат, предизвикани од грешка при реакцијата на енолизација-карбоксилација. Кај повисоките растенија, овој процес предизвикува самоинхибиција на RuBisCO, која може да се активира со заситени концентрации и RuBP и да се реши со активаза на RuBisCO.
Стапка на ензимска активност мини|Преглед на Калвиновиот циклус и фиксација на јаглерод. Некои ензими можат да спроведат илјадници хемиски реакции во една секунда. Сепак, RuBisCO е бавен, фиксирајќи само 3-10 молекули на јаглерод диоксид секоја секунда по молекула на ензим. Реакцијата катализирана од RuBisCO е, според тоа, примарен фактор за ограничување на брзината на циклусот на Калвин во текот на денот. Сепак, под повеќето услови, и кога светлината не ја ограничува фотосинтезата на друг начин, брзината на RuBisCO реагира позитивно на зголемувањето на концентрацијата на јаглерод диоксид.
RuBisCO е обично активен само во текот на денот, бидејќи рибулоза 1,5-бисфосфатот не се регенерира во темно. Ова се должи на регулацијата на неколку други ензими во циклусот на Калвин. Покрај тоа, активноста на RuBisCO е координирана со онаа на другите ензими од циклусот на Калвин на неколку други начини:
Регулација со јони По осветлувањето на хлоропластите, pH вредноста на стромата се зголемува од 7,0 на 8,0 поради протонскиот (водороден јон) градиент создаден низ тилакоидната мембрана. Движењето на протоните во тилакоиди е поттикнато од светлината и е фундаментално за АТФ-синтезата во хлоропластите. За да се балансира јонскиот потенцијал низ мембраната, магнезиумовите јони се поместуваат од тилакоидите како одговор, зголемувајќи ја концентрацијата на магнезиум во стромата на хлоропластите. RuBisCO има висока оптимална pH вредност (може да биде >9,0, во зависност од концентрацијата на магнезиумови јони) и, на тој начин, се „активира“ со воведување на јаглерод диоксид и магнезиум во активните места како што е опишано погоре.
Регулација со RuBisCO активаза